浅谈微藻生物柴油

刘婷

（国家知识产权局专利局审查协作广东中心，广东广州 511363）

1 微藻柴油的优势

目前，全球1/5的二氧化碳排放来自交通部门。预计到2050年，全球道路上轻型机动车的数量将增加到20亿辆[1]，减排前景并不乐观。由于供应量的减少，原油的成本将不断增加，从而使天然来源的燃料生产更为可行。由于CO2等气体的释放，化石燃料的持续使用将进一步加剧气候变化。生物柴油是从微藻油中提炼出来的，因此，在不久的将来，生物质微藻油将替代石化石油，成为可生物利用的生物柴油。生物柴油是由甘油三酯或游离脂肪酸与短链醇酯交换制备的单烷基酯，具有在常规柴油机中很少或不需要改性的能力，而且已被证明比石化柴油的生态毒性少。研究结果表明，浓度大于3%（W/W）的柴油对土壤微生物具有毒性，而生物柴油在整个土壤饱和时是无毒的[2]。随着环境问题日益被关注，这些因素在生物柴油的可接受性中起着重要的作用。第一代生物燃料已经问世一个多世纪，生物柴油目前在美国由大豆生产。生物柴油的来源包括菜籽油、动物脂肪、棕榈油、玉米油、废食用油和麻风树油。植物油在燃料生产中的应用一直备受争议，如需要耕地等资源，耕地的数量可能不足以满足指定区域的燃料需求，并会极大地影响粮食安全。目前，全球可用耕地的1%用于农作物生物燃料（第一代生物燃料）的生产，这种燃料仅满足1%的全球燃料需求[3]。从替代来源的研究来看，微藻生产生物柴油被誉为最合适的石化柴油替代品。微藻是世界上最大的生命类群自养微生物。微藻的生长率较高[4]，可以迅速积累比陆地植物更多的脂质，其脂质作为中性脂质储存。微藻油和废生物质为生物柴油原料提供了良好的潜在来源。

不同于油料作物，微藻的生长周期非常短，其在一个年份能够进行多次连续的收获[5]。微藻具有较高的太阳转化率，脂质生产率较高。微藻产生的脂质通常是中性脂质，具有高水平的饱和度，使其成为生物柴油生产的合适原料。微藻生长速度快，繁殖时间短。微藻在24 h内将生物量增加1倍，有些物种的繁殖时间短于3.5 h，即每天多生物量分裂。微藻理论产量可以达到47000～308000 L/hm2生物柴油。相比之下，棕榈油每年可以生产5 950 L/h·m2的生物柴油[6]。微藻比植物需要更少的培养用新鲜水源。微藻栽培可以在非耕地中，在微咸水中发生，从而减少对生产粮食作物所需资源的侵占，同时减少对其他环境影响。不需要使用除草剂或杀虫剂之类的化学物质，从而降低成本和环境影响[7]。此外，这些微生物需要相当少的土地，据估计只需要含油作物2%的土地就能生产和含油作物同样数量的生物柴油。微藻可以有效地去除废水中的磷酸盐和硝酸盐。废水可以成为培养生产生物燃料的微藻的理想基质，同时使微藻成为废水的三级处理手段。一些微藻生产有价值的副产品，其形式为蛋白质、色素、生物聚合物和含有二十二碳六烯酸和类胡萝卜素的碳水化合物，包括商业或医药用途的抗氧化剂物质。与油料作物相比，微藻与采油和运输有关的成本较低，可以使用提取后残余的生物质作为肥料或生产其他高能产品来提高经济性。微藻生物柴油在环境方面十分有利，因为它是一种车用中性燃料，由大气二氧化碳的光合固定产生[8]。微藻生物柴油具有与石化相似的性能，包括密度、黏度、闪点、冷流和热值。生物柴油的其他潜在来源中，没有一个像微藻柴油替代石油、柴油一样在可持续性方面是现实的，这主要是由于使用其他原料引起的环境影响。热解作为生物柴油生产的另一种方法，以微藻生物作为原料比木质纤维素生物质更具成本效益，微藻中含有更多的细胞脂质、多糖和蛋白质，它们更容易热解并导致更高质量的生物柴油生产[9]。

2 微藻利用所面临的挑战

微藻、微藻柴油的分离是使用微藻生产生物柴油的主要挑战之一。储存脂质的微藻通常是单细胞的，密度低，在悬浮液中难以被分离。微藻脂质大规模提取过程复杂，仍处于发展阶段，目前正在进行研究以解决这些问题。在开放池塘系统中生长的微藻易于接触细菌，细菌污染竞争营养物质和氧化有机物质，可能导致培养物的腐败。异养细菌的控制可以通过提高pH值来实现。在藻类积水系统中普遍发现的需氧菌的最适pH为8.3，使pH超过这个水平能够有效地抑制，从而通过影响氮吸收效率来防止竞争[10-11]。开放系统也易受到原生动物和浮游动物形式的捕食者的攻击，这些生物能在相对短的时间（2～3天）中破坏藻类密度。浮游动物可以在48 h内将微藻密度降低90%，而水蚤可以在几天内将微藻密度降低99%[12]。控制这些生物的方法有多种，如过滤、离心、低溶解氧（DO）、激素的应用和游离氨的增加。然而，这些方法的缺点是过滤困难，因为微藻物种的大小，例如小球藻，使分离很困难。大规模离心需要高昂的资本和昂贵的能源投入。据估计，每公顷每年需要6～8 t硝酸盐，相当于大田作物需求量的55～111倍。通过使用废水作为生长基质，可减轻相关成本。同时，使用生物柴油作为燃料，它易受到细菌氧化，随后导致储罐的内部腐蚀。大量的甘油会作为副产品产生，很可能会淹没市场，从而使价格降低。在酯交换过程中使用的甲醇目前来源于原油。这些挑战可以通过改进生物柴油储存罐的设计等措施来克服，可以通过引入生物精炼厂的概念来克服精炼过程中较高的成本需求，其中通过生物质转化为能量，从而使生产过程无废料。大量生产的甘油可用于制造价值更高的产品，或在第三世界国家中以肥皂和蜡烛的形式造福社会。作为生物炼制概念的一部分，可以有效地利用甘油作为发酵原料生产甲烷。生物柴油在未来有可能成为100%的生物燃料[13]。

3 微藻生产油脂的筛选

筛选产油微藻是优化生物柴油生产的重要部分。某些菌株如Botryococcus braunii具有高的脂质储存潜力（高达75%的脂质/g干细胞重量），但这伴随着低生产率。适度的脂质积累水平（20%～50%），产脂率较高的微藻培养物是大规模培养优选的菌种。除了脂质代谢的因素，脂质分布在特定的环境条件下生长的能力也需要被考虑。脂质的分布受营养、加工和滴定条件的影响，选择标准应以多种因素为基础，包括生长速率、脂类数量和质量、对环境变化的强适应性和优选营养素和养分吸收率的测定[14]。为了获得高的收油率，必须确定在正常条件下产生的油量。从规模经济的角度来看，产量优化非常重要。可以通过限制控制生长的一个或多个变量来诱导静息期的微藻，如限制氮、磷或硅[15]。微藻适应环境变化通常是通过脂质结构的变化和合成各种在用于抵抗环境变化的化合物来完成的[16]，这可能是微藻在承受压力的条件下过度产生脂肪酸的原因。因此，可以通过氮饥饿或其他应激因素诱导或增强脂质含量营养不足，如将培养环境中的硅耗尽可能诱导细胞脂质含量的增加。通过硅饥饿可以使硅藻Navioua pelliculosa增加60%的脂质含量。据报道，在干重的基础上，脂质组分可以高达70%～85%。这样的高脂质含量超过大多数陆地植物的含量。

某些硅藻具有通过某种机制迅速从碳氢化合物积累转变为脂质积累的能力。硅藻在微藻脂质生产中的应用极具潜力。在生长的早期阶段，产生大量极性脂质和多不饱和的C16和C18脂肪酸。这与在接近生长静止期时产生的主要脂质不同，其通常由中性饱和的18-1和16:0长链脂肪酸组成。然而，脂质成分的变化一般取决于藻的种类，比如蓝绿色微藻在生长周期中的组成变化相对较小。温度和光在产生脂质的类型中也起作用。光照促进了Euglena gracils 和Chlorella vulgaris中多不饱和C16和C18脂肪酸，以及单和双半乳糖基甘油二酯、鞘脂和磷酸甘油酯的产生。用Monochrysis lutheri合成多不饱和C18脂肪酸，Dunaliella salina的脂肪酸组成的变化都可以通过低温条件下的生长来实现[17]。

水环境中盐含量变化所引起的应力可以影响微藻细胞内含有的脂质量。在1 mol/L NaCl中生长的盐水微藻细胞内脂类和三酰甘油（67%和56%脂质）含量显著高于0.5 mol/L NaCl（60%和40%脂质）的培养物。据报道，Dunaliella salina细胞响应于增加的NaCl浓度分泌甘油[17]。

不同种类的微藻产生的脂肪酸不同，需要进行脂质的验证。有些脂肪酸比其他脂肪酸更适合于生物柴油的酯交换反应。大多数微藻油富含多不饱和脂肪酸，具有4个或更多的双键。与这种程度的多不饱和有关的问题是，这些脂肪酸和脂肪酸甲酯（FED）在储存过程中易氧化，它们在生物柴油中的可利用性比较低。大规模培养所需的菌株在规模较大的培养条件下，必须产生适宜的油脂。然而，这是难以确定的，因为开放系统的模拟依赖于许多因素，不能准确地在实验室中被执行。微藻生长需要丰富的营养基质，利用更便宜的可用底物如废水的可能性，可以使该方法在经济上更可行。

4 筛选培养基的选择

微藻的生产需要氮和磷等重要无机营养物。微藻类已知的营养需求不仅包括营养成分的种类，而且还包括所提供的营养物质的浓度。因此，微藻生长培养基通常由氮源、磷酸盐和金属螯合剂组成的营养素组成。铁一般以微量营养素的形式供应。小球藻已知在营养丰富的培养基中生长相当好，在1.25 g/L KNO3的WATANABE培养基中小球藻的生长状态很好。培养条件的改变可以作为一种操纵代谢途径的机制，从而导致细胞功能的重新定向，以生产所需的产品，如中性脂质。营养过于丰富的培养基可能会导致营养毒性引起的死亡。筛选培养基中的营养条件，理想地应该是将营养浓度范围从低到高依次进行筛选，以便排除潜在的营养缺乏或过量的营养供应。应注意，过多的添加酵母提取物和其他可能支持细菌生长的成分会引起细菌的生长。细菌的过度生长可通过诱导缺氧条件或引起培养毒性引起微藻死亡。

全球能源危机迫使人们寻求替代和环境友好的能源。在过去的20年里，注意力转向研究开发和优化生物燃料技术。在这方面，微藻中的生物柴油显示出作为一种合适的替代物的潜力。然而，实验室中试结果显示，大规模商业应用仍然存在着很多障碍，包括菌种选择、种子培养、生物量和油脂产量优化，生物反应器的配置、物理化学参数和脂质提取、优化等最重要的环节。因此，实现微藻柴油完全替代石化柴油仍有许多的努力要做。