结核病疫苗研究

彭宝洲，刘梓健，粟海波

（广州医科大学-广州生物医药与健康研究院联合生命科学学院，广东广州 511436）

1 前言

1.1 结核病现状

结核病是全球第九大死因，也是单一病原体感染造成的主要死因，高于HIV病毒，是传染病死亡人数之首。据估计，2016年全球结核病新发病例数为1 040万例，167.4万例死于结核病，其中34.7万人合并感染HIV病毒。全球约有1/4的人口有结核分枝杆菌潜伏感染（latent TB infection，LTBI）[1]。

中国是世界上结核病高负担国家之一，结核病患者数量居世界第三。结核病是中国农村因病致贫、因病返贫的主要疾病之一，严重制约我国经济和社会的发展[2]。

1.2 结核病的致病机制

结核病由结核分枝杆菌（Mycobacterium cuberculosis，Mtb）引起，Mtb已发展了许多机制来避免被吞噬细胞杀伤，特别是单核吞噬细胞。在宿主细胞内，Mtb寄居于吞噬体内且阻止吞噬体间的融合。通过ESX-1分泌系统破坏吞噬体膜，抗原可以进入胞浆，其本身也可能进入胞浆。Mtb抗原可与Ⅰ型MHC和Ⅱ型MHC结合分别被CD8+和CD4+T细胞识别，而Mtb可以下调Ⅱ型MHC的表达以减弱CD4+T细胞反应，抑制CD4+T细胞的积累[3]。

Mtb在活性阶段和休眠阶段的基因表达有很大的差异。活性Mtb表达复制和高代谢活性的遗传程序，包括毒力因子的表达以帮助其入侵宿主细胞，灭活或破坏宿主的防卫机制并破坏其组织；而在休眠阶段，Mtb几乎没有代谢、复制、毒力的基因表达[4]，由此来逃避免疫。休眠期Mtb表达的抗原被称为休眠抗原，从更广泛的意义上讲，休眠抗原还包括营养缺乏和有效免疫控制下表达的抗原。休眠期Mtb减少了毒力表达和对宿主细胞的破坏，与此同时，它对免疫系统却是一个难题，其持续感染健康个体，导致结核分枝杆菌潜伏感染（LTBI）。一旦宿主的免疫能力低下，Mtb即可从休眠阶段复苏返回活性阶段，传播和进入新宿主。在全球范围内，估计有20亿人拥有LTBI，且绝大多数人将终生维持这一状态，只有约5%的LTBI患者会在感染的头几个月内发展成结核病，主要发生在儿童和免疫功能低下的患者特别是HIV+个体中。另外，少数的LTBI患者可维持这一状态数年至数十年，通过再活化或再感染而发病，这些个体在免疫功能足够强力时压制着Mtb，在后期免疫力减弱时发病。

同时，耐多药结核病（MDR-TB）也给全球的结核病疾病控制带来了巨大的挑战。2016年，全球有60万耐利福平（最有效的一线药物）的新病例，其中49万为耐多药结核病。全球数据显示，接受治疗的耐多药结核病患者平均治愈率仅为54%。最近报道了几乎定义为完全耐药结核病的病例，表明人类结核病正在加入进入抗生素后时代的细菌性疾病[5]。

1.3 目前主要疫苗

卡介苗（Bacille Calmette-Guérin，BCG）是目前唯一一种用于预防儿童结核病的预防接种疫苗。相比较牛分支杆菌与Mtb，BCG缺乏了多个基因组片段。其主要减毒原因是RD1（the Region of Different 1）基因，该基因编码免疫显性抗原，包括ESAT-6、CFP-10以及分枝杆菌独有的ESX-1 Ⅶ型分泌系统。

虽然BCG对结核病的预防功不可没，还能通过刺激非特异性免疫系统来对抗常见疾病[6]，但研究表明，BCG仅对预防儿童结核病有效，而对青年和成人结核病没有保护作用且其作用具有地域性。所以，更加安全有效的疫苗是人们的迫切需要。

近年来，一些新型结核病疫苗已进入临床试验的不同阶段，本综述对全球结核病疫苗进行系统简述，包括重组卡介苗、亚单位疫苗、病毒载体疫苗、治疗性疫苗等。

2 国内外结核病疫苗研究现状

2.1 重组卡介苗

目前，卡介苗显然不足以控制全球结核病，而重组BCG旨在代替目前的BCG疫苗[2-3]。

锌蛋白酶由zmp1基因编码，致病性分支杆菌依靠该蛋白短暂停止吞噬体的成熟；BCG Δ zmp1将zmp1基因移除可使更多活疫苗被运往成熟的吞噬体，增强Ⅱ型MHC受限抗原的呈递，已进入临床前试验阶段。

BCG Δ ureC::hly（VPM1002）将单核细胞李斯特菌hly基因整合至BCG。hly基因可编码溶血性穿孔蛋白溶血素O能在吞噬体膜上穿孔，其最适pH为5.5。ureC基因编码尿素酶C，尿素酶C缺失可促进吞噬体内的酸性环境，保证溶血素活性。穿孔可以使细菌的蛋白质和DNA进入宿主细胞胞浆，导致Ⅰ型MHC受限抗原呈递增强、细胞凋亡和细胞自噬。BCG Δ ureC::hly被证实在成人中有免疫原性，甚至能用于HIV+患者，已进入临床IIb期试验。

此外，BCG Δ ureC::hly还有新的改进方案：BCG Δ ureC::hly Δ nuoG 和 BCG Δ ureC::hly Δ pdx1。

nuoG是BCG中的抗细胞凋亡毒力基因，编码NADH 脱氢酶1亚基G。BCG Δ ureC::hly Δ nuoG 比BCG更安全，并且改善了对亲本BCG Δ ureC::hly的保护，显著降低了鼠肺中的TB负荷并增强了免疫应答，具有优异的疗效和安全性。

pdx1是细菌和真菌的维生素B6合成基因，该基因的缺失使得维生素B6营养缺陷型Mtb显著抑制了其在小鼠中的存活。BCG Δ ureC::hly Δ pdx1在皮下免疫小鼠中显示明显受限的播散，该疫苗的比亲本BCG Δ ureC::hly更安全，甚至有望用于HIV+婴儿。

BCG ::pfo（AERAS-422）疫苗加入了产气荚膜梭菌溶血素基因，且表达了3个抗原——Ag85A、Ag85B、Rv3407，其中Rv3407是在Mtb从休眠状态复苏时表达的抗原。然而，该疫苗在临床Ⅰ期试验中存在安全性问题而被终止。

BCG ::ESX-1将ESX-1基因插入BCG中，ESX-1 T7SS是BCG减毒的主要原因，但ESX-1分泌蛋白是重要的抗原物质。这些抗原物质Mtb能产生，而BCG不能。该疫苗在临床前试验中表现出更强的免疫原性，但其毒性会增强。最近，有使用亲缘关系更疏远的海鱼分枝杆菌的ESX-1基因来补充BCG（BCG::ESC-1Mmar），这个结构比BCG ::ESX-1Mtb更加安全有效，已进入临床前试验阶段。

Mtb Δ phoP Δ fadD26（MTBVAC）疫 苗 来 源 于Mtb株系MT103。phoP基因编码转录因子，控制分枝杆菌的胞内适应并促进ESAT-6的分泌。fadD26是脂质合成基因，与细胞壁形成、细菌毒力、胞内存活相关。该疫苗的安全性与BCG相当，且免疫原性和保护力更强，能CD4+T细胞数量。高度减毒的MTBVAC可能成为高风险免疫抑制人群的潜在疫苗，现该疫苗已进入临床Ⅰ期试验阶段。

BCG ::AB疫苗插入了抗原Ag85A和Ag85B的基因，和BCG相比有更高的Ag85A和Ag85B蛋白过表达水平。BCG ::AB可提供更强更持久的保护作用，已进入小鼠保护实验。

BCG ::AR疫苗包含了Ag85B和Rv3425基因，Rv3425是PPE家族亚组3的成员，在所有BCG菌株中都不存在。该疫苗接种小鼠后，增强了Th1细胞应答，提升γ干扰素水平，具有比BCG更强的保护效力。该疫苗已进入临床前实验阶段。

BCG ::GCE是一个共表达人GM-CSF和结核杆菌特异性抗原CFP10与ESAT6的重组卡介苗，该疫苗免疫小鼠后，血清特异性抗体滴度迅速升高，脾淋巴细胞增殖、CD4+和CD8+T细胞比例及γ干扰素分泌也增加，已进入小鼠保护实验。

2.2 亚单位疫苗

亚单位疫苗在BCG注射后使用，主要用于增强BCG诱导的免疫反应。大部分重组卡介苗的主要使用人群是儿童和青年，将重组卡介苗与亚单位疫苗结合使用，可以将他们的应用扩大到成人群体中[2,7]。

M72是PPE家族成员Rv1196（Mtb39A）和丝氨酸蛋白酶Rv0125（Mtb32A）的融合蛋白，加佐剂AS01E；M72/AS01E疫苗具有免疫原性并兼顾临床上可接受的安全性，能诱导CD4+T细胞对M27的特异性免疫应答和体液免疫，且该疫苗对LTBI人群具有较好的安全性，已进入临床IIb期试验。

Hybrid 1是Ag85B和ESAT-6的融合蛋白，Hyvac 4是Ag85B与TB10.4的融合蛋白。两种疫苗都使用佐剂IC31，且能持续有效地诱导免疫应答，均已进入临床IIa期试验。

Hybrid 56是利用了休眠抗原的疫苗，这个疫苗不仅包含了早期分泌抗原ESAT-6和Ag85B，而且还包含潜伏感染抗原Rv2660。Rv2660基因产物在胁迫条件下表达，被认为是休眠抗原，本身具有弱免疫原性。将Rv2660与ESAT-6、Ag85B结合后，在实验动物模型中保护性免疫应答显著提升，能增强BCG对猕猴抵抗Mtb感染的保护作用。该疫苗已进入临床Ⅱ期试验。这个疫苗代表了TB疫苗开发的一大进步，因为其包含的抗原在感染的不同阶段即可识别。此外，一项H56 cDNA的临床前内皮注射小鼠试验中，H56 cDNA诱导了特异性CD4+T细胞应答和Ag85B IgG抗体，改善肺部病理[8]。

融合蛋白ID93包含3个毒力蛋白Rv2608、Rv3619、Rv3620和1个休眠蛋白Rv1813。ID93/GLA-SE与Hybrid 56亚单位疫苗都包含了不同感染阶段的抗原。在小鼠中，ID93和佐剂GLA-SE组合使用诱导了多功能CD4+Th1细胞应答，以及随后感染动物的肺中细菌数量减少。在豚鼠实验中，ID93与BCG组合使用还降低了死亡率。蛋白亚单位疫苗ID93/GLA-SE可预防动物中的结核病和耐多药结核病，并且可以提高儿童BCG疫苗的保护效力，已进入临床Ia期试验。

LT70疫苗将抗原ESAT-6、Ag85B、MPT64的肽190-198、Mtb8.4和潜伏期相关抗原Rv2626融合共同构建为多级蛋白LT70，LT70可被来自结核病人和LTBI患者的T细胞识别并产生免疫应答，具有更高的保护效力，已进入小鼠保护实验。

重组结核疫苗AEC/BC02是由重组MTB抗原Ag85B、ESAT-6、CFP-10与复合佐剂BC02构成的亚单位疫苗，该疫苗免疫原性强，在豚鼠实验中多次注射免疫后没有观察到明显的Koch现象，具有较高的安全性。该疫苗有望用于LTBI患者，已进入临床前实验。

2.3 病毒载体疫苗

病毒载体疫苗主要以痘苗病毒、腺病毒、仙台病毒为载体构建结核病新型疫苗，主要用于免疫加强或预防性免疫[9]。

MVA85A一种表达抗原Ag85A的改进后的安卡拉牛痘病毒，改进后的痘苗病毒虽然不能在哺乳动物细胞中复制，但能表达蛋白，诱导T细胞应答。该疫苗在多年前已接种BCG的个体中也能诱导二次免疫应答，仅观察到轻微的不良反应，在LTBI患者中也有相似的免疫效果。但在临床IIb期试验中对儿童没有表现出免疫效力，以失败告终。

重组腺病毒载体特别适用于诱导强烈的T细胞免疫。Ad35-TBS（AERAS-402）是这一类型疫苗中较先进的一种，是基于Ad35型的病毒载体疫苗，它表达了Mtb抗原Ag85A、Ag85B和TB10.4的独特融合蛋白。在动物模型中，通过鼻内或肌内途径施用给小鼠赋予了针对Mtb的保护作用，能诱导CD4+和CD8+T细胞免疫应答。该疫苗已进入临床I期试验阶段。

Ad5Ag85A是一种基于复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体的疫苗，这个疫苗仅表达抗原Ag85A。这个疫苗通过鼻内给药而不是肌肉注射，在临床Ⅰ期试验中表现出高免疫原性，能刺激多功能T细胞应答，比BCG更有效地提高了CD4+和CD8+T细胞免疫。该疫苗能提高BCG的保护效力，已进入临床I期试验。

Ad5-CEAB也是一种通过鼻内滴注的腺病毒载体疫苗，其表达的抗原包括CFP-10、ESAT-6、Ag85A、Ag85B。在小鼠模型中，该疫苗能导致强烈的抗原特异性免疫应答以及体液应答，已进入临床前试验阶段。

TB/ FLU-04L是由流感病毒株A/Puetro Rico/8/34 H1N1和Mtb抗原Ag85A、ESAT6组成的重组流感疫苗。该疫苗正在计划进行IIa期试验。

2.4 治疗性疫苗

治疗性疫苗设计的主要目标是预防潜伏感染或减少化疗的持续时间[2,7,10]。

M.Vaccae是通过灭活母牛分枝杆菌全细胞株开发的，其耐受性良好，没有报道严重的不良反应。该疫苗具有有效的免疫原性和安全性，已进入临床Ⅲ期试验，目前正在中国接受针对LTBI患者的有效性和安全性试验。

MIP是一种快速生长的非致病性腐生菌，在一项小鼠模型研究中，通过气雾剂给药时，MIP具有比BCG更高的免疫原性和保护效力。该疫苗已进入临床Ⅲ期试验。

RUTI是由脂质体递送的解毒、半纯化的Mtb细胞碎片制成的治疗性疫苗，这些Mtb在胁迫和饥饿条件下培养而成，该疫苗的疗效得益于Mtb在肉芽肿病变中通常表达的休眠期抗原的富集。研究显示，RUTI在小鼠和豚鼠中显示出控制结核感染潜伏形式的功效，在短期化疗后诱导多抗原反应和抗体产生。该疫苗已进入临床IIb期试验。

Ag85A/B DNA是一个DNA疫苗，将Ag85A和Ag85B基因插入到质粒载体中，在Ag85A/B嵌合DNA肌肉注射小鼠免疫治疗实验中，小鼠显示出显著的免疫反应，对治疗结核病有效。已进入临床前实验。

分枝杆菌obuense衍生的DAR-901是一种多抗原热灭活全细胞疫苗，该疫苗使用肉汤培养方法制造，与Mtb共享多种抗原，因此可以提供交叉保护。DAR-901旨在成为艾滋病毒感染和未感染艾滋病毒的青少年和成人预防结核病的强化疫苗，该疫苗已进入临床IIb期试验。

3 结核病疫苗研究中存在的问题、对策与展望

3.1 存在的问题与对策

目前，全球的结核病疫情日益严峻，主要存在以下几方面问题有，（1）不同地区BCG的特异性差异。（2）MDT-TB的出现使疫情控制困难，疫情下降缓慢或有所回升。（3）Mtb与HIV的合并感染；目前没有十分适用于HIV+患者的疫苗，BCG也同样不能用于HIV+患者。HIV感染使BCG失控增长和传播，导致卡氏病的出现，因此HIV+儿童不能接种BCG。（4）Mtb与寄生虫感染；寄生虫感染使患者Th细胞向Th2极分化，对抗寄生虫；而Th2细胞将下调Th1细胞，从而降低对TB的保护。（5）疫苗的人群特异性问题。（6）疫苗的评测需要更优良的模型；研究发现很多实验的免疫结果与实际使用效果不符。

对于这些问题，可以采用的对策有：（1）对前人的临床实验失败进行总结，吸取经验教训；（2）对不同的BCG菌株进行鉴定；（3）随着MDR-TB的出现，未来患者的治疗应考虑药物和治疗性疫苗联合使用的手段；（4）开发针对不同人群的结核病疫苗，如HIV+患者、儿童、老年人等易感人群；（5）创建新的疫苗评估模型。

3.2 对未来的展望

未来将有越来越多的结核病候选疫苗进入临床试验阶段，疫苗的测试需要更多的经费和更大的平台。对于未来结核病的发展方向，应如下：（1）研制安全性和保护力强于BCG的疫苗以代替BCG；（2）采用初始免疫和增强免疫相结合的策略，如改良BCG和亚单位疫苗共用；（3）研发可针对所有年龄人群的多阶段亚单位疫苗，特别是对休眠抗体的研究；（4）未来的疫苗应考虑利用BCG非特异性免疫的潜在作用。

世界卫生组织《终止结核病策略》确定的具体目标有：在2015年基础上，到2030年将结核病死亡人数减少90%，将结核病发病率降低80%。为了实现这些目标，需要科学和社会层面的密切合作，世界各国各地区的共同努力。