王秀媛
侵袭性肺真菌病(invasive fungal disease,IFD)的主要病原体有曲霉、隐球菌和假丝酵母菌[1-2],已经成为临床常见的感染性疾病,合理选择抗真菌药物治疗至关重要[3]。对涂片进行革兰染色检查是病原学诊断的经典方法,也是最直接、最简便、最快捷的鉴定方法[4]。通常镜下鉴别真菌时,是依据其形态学特点来进行区分的,但是在不同来源的标本中,有的真菌菌丝的形态特点并不典型,很难区分[5]。而规范的标本涂片革兰染色可将不同的真菌菌丝染成阴性或阳性菌丝体,可作为真假菌丝鉴别方法之一。
1.1 标本来源 收集2016年1月—2017年6月我院门诊及住院患者的1 718例痰液标本。
1.2 仪器和试剂 VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定系统及真菌鉴定卡(法国生物梅里埃公司),奥林巴斯显微镜,沙保弱琼脂平板(金章公司),革兰染色液(贝索生物技术有限公司)。
1.3 方法 对收集的1 718例痰液标本进行涂片,涂片应薄切均匀(透过涂片部位可看清下面印刷品的字迹)。自然干燥后,经火焰快速固定3次,革兰染色,晾干后读片。之后将痰涂片上发现真菌菌丝的370例痰液标本接种于沙保弱琼脂平板,培养24~48 h,并进行鉴定。
1.4 统计学方法 对上述革兰染色不同的两种真菌菌丝的实验数据进行处理,非配对资料用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 1 718例痰液标本革兰染色镜检结果 1 718例痰液标本中,有318例经革兰染色涂片后发现革兰阳性的真菌菌丝,如图1a;有52例经革兰染色涂片后发现革兰阴性的真菌菌丝,如图1b;其他标本未发现真菌菌丝。
图1 1 718例痰涂片革兰染色镜检结果
2.2 370例痰液标本培养鉴定结果 上述370例发现真菌菌丝的痰液标本中,318例革兰阳性的真菌菌丝痰液标本生长的菌落均为酵母型,经鉴定其中286例为白假丝酵母菌,32例为其他酵母菌,如热带假丝酵母菌、副热带假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌等;52例革兰阴性的真菌菌丝痰液标本生长的菌落均为霉菌型,经鉴定其均为曲霉菌。
2.3 两种方法结果比较 370例痰液标本中真菌菌丝的革兰染色结果和培养鉴定结果一致(P>0.05),见表1。
表1 痰标本涂片革兰染色结果与培养鉴定结果的比较
我国IFD的主要病原体为曲霉、隐球菌和假丝酵母菌,而肺是IFD最常见的靶器官[6-8]。通常感染真菌的患者痰液中可见真菌的真菌丝体,如曲霉菌感染患者;以及假菌丝体,如白假丝酵母菌感染患者[4,9-10]。两种菌丝在痰液标本中有时依据形态特点不太容易区别。如果对规范的标本涂片进行革兰染色后,由于假丝酵母菌的假菌丝被染成革兰阳性,曲霉菌菌丝被染成革兰阴性,故可作为鉴别菌丝的主要依据[6]。
在选择抗真菌感染用药方面,氟康唑对除克柔假丝酵母菌和光滑假丝酵母菌外的其他假丝酵母菌都是高度敏感的,而且易口服吸收、安全、组织穿透力强等优点;而曲霉菌中的烟曲霉、黄曲霉、土曲霉等对氟康唑是天然耐药的[11-14]。我们通过痰液涂片革兰染色观察真菌的形态特点,结合染色属性区分感染的真菌类型,可在1~2 h内为临床提供抗真菌用药的参考依据,为临床有效的诊断治疗提供重要信息。
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