水稻萌发过程中油菜素内酯影响淀粉代谢的效应及其机制

李钱峰， 余佳雯， 鲁 军， 熊 敏， 张昌泉， 刘巧泉

(扬州大学农学院，江苏扬州 225009)

水稻是世界上1/2以上人口的主粮，而淀粉是稻米的主要成分，占稻米干质量的80%～90%。因此，淀粉的组成、结构和理化特性对稻米的功能和品质均有着重要影响。淀粉按功能可以分为瞬时淀粉和贮藏淀粉。瞬时淀粉存在于植物光合组织中，白天积累而夜间降解，作为重要的碳源库在植物不能进行光合作用时为其提供生长发育所需的物质及能量。贮藏淀粉主要分布在异养型组织中，如根、种子或者块茎中，能够长期储存，其合成的最初底物来自于光合作用合成的蔗糖[1]。贮藏淀粉的一个重要作用是为种子的萌发提供物质和能量。而根据淀粉的分子结构特征，淀粉分为直链淀粉(Amylose)和支链淀粉(Amylopectin)这2大类。直链淀粉是α-1，4 糖苷键连接而成的葡萄糖聚合体，它是一种线性大分子，没有或很少有分支。支链淀粉则是在α-1，4 糖苷键连结葡萄糖残基所形成的长链上再通过α-1，6糖苷分支键连接而成的葡萄糖聚合体，分支链的数量变化较大，各分支链的长度也不一致，其分子量比直链淀粉要大得多[2]。

除此之外，水稻种子也是重要的农业生产资料，其休眠和萌发特性可直接影响水稻的品质和产量。如种子一定程度的休眠可以避免成熟时穗萌，减少稻米产量损失和品质下降；而水稻种子萌发为水稻生产的第1步，良好的种子萌发是水稻幼苗形态建成的基础。播种后种子是否能够顺利破土萌发，以迅速达到早苗、壮苗和全苗的标准，会直接影响到水稻的种用价值和产量，进而关系到我国的粮食安全。因此，种子的休眠与萌发研究一直受到国内外学者的高度关注。种子萌发指种子从开始吸水至胚根突破种皮的一系列有序的生理和形态发生过程。种子萌发受多种内在和外部因素的影响，主要包括种子含水量、成熟度、休眠情况、温度、光照、空气、植物激素等[3]。植物激素在种子的萌发调控中发挥着重要作用，其中最主要的2种激素是赤霉素(GA)和脱落酸(ABA)，他们互相拮抗调控种子的萌发过程[4]。此外，植物激素油菜素内酯(BR)在种子萌发中的作用也有相关报道，包括BR在种子萌发阶段的生理效应和初步的调控机制[5-7]。但总体而言，有关BR在种子萌发中的相关研究还较少，特别是在单子叶模式植物和重要作物水稻中，BR调控种子萌发的效应和调控机理仍不清楚。

BR家族包含几十种天然油菜素甾醇类物质，其中BL是活性最强的一种，因此常用于植物激素的相关研究中。本研究首先分析了BL处理对水稻种子萌发的影响，并结合之前蛋白组学的研究结果，利用已创建的淀粉合成关键基因启动子融合GUS报告基因的转基因水稻，研究萌发阶段BL对部分淀粉合成关键基因表达的影响；此外，进一步提取萌发水稻种子中的淀粉，利用扫描电镜、傅里叶红外光谱、X射线衍射等方法分析BL处理对胚乳中淀粉结构和理化特性的影响。相关研究结果为后续深入研究BR通过调控稻米中淀粉代谢过程来影响水稻萌发，并进一步解析BR调控水稻萌发的分子机制提供了重要信息。

1 材料与方法

1.1 水稻材料及生长条件

本试验主要以水稻成熟的种子为研究材料开展种子萌发的相关研究，具体包括粳稻日本晴、粳稻9983及以其为受体创建的proAGPS1-GUS、proWx-GUS和proSBE1-GUS转基因水稻。试验材料按照宽窄行种植于扬州大学农学院试验基地，行株距为(25.2 cm+16.2 cm)×12.8 cm，每个小区2行，每行10株。全生育期灌浅水层，精细管理，严格控制病虫害，至成熟时收获种子，供后续萌发试验分析。

1.2 水稻种子萌发试验

将日本晴、粳稻9983及其相关的启动子融合GUS报告基因的转基因成熟种子进行人工去皮，首先用70%乙醇洗2遍灭菌消毒，再用超纯水洗2次，之后放于内置2层灭菌滤纸的圆形培养皿中，每个培养皿内含有1 μmol/L的BL或其溶剂DMSO对照溶液，然后置于28 ℃和70%相对湿度的黑暗环境下进行萌发试验，每隔12 h取样拍照直至72 h。

1.3 GUS活性测定

待启动子融合GUS基因的转基因水稻种子萌发72 h后，收取材料用于GUS荧光定量测定，测定方法参照Jefferson等的方法[8]进行，总蛋白含量的测定按照Bradford的方法[9]进行。

1.4 稻米淀粉提取

待日本晴种子萌发36 h后，收取材料用于淀粉提取及后续淀粉的理化特性分析。为减少碱法提取过程中对淀粉结构的破坏，本试验中稻米淀粉的提取采用湿磨法结合中性蛋白酶的方法，在参考Zhu等的方法[10]基础上加以改进，具体方法为称取10.0 g精米并加入适量体积的碱水(pH值8.0～8.5)，室温下浸泡过夜后，倒去浮液，加入1倍固体体积的0.001 mol/L NaOH溶液，用组织匀浆机搅匀后再加入约1倍固体体积的0.001 mol/L NaOH溶液，用1 mol/L NaOH调pH值到9.5，向匀浆液中加入0.5 g的碱性蛋白酶，于42 ℃下磁力搅拌18 h。消化过的匀浆液过200目筛，并以3 600g离心20 min，用去离子水悬浮沉淀，并再次以3 600g离心20 min。重复上述清洗过程3次以去掉淀粉中残留的离子，最后用95%乙醇洗3次，40 ℃烘干后用塑料袋密封放置于4 ℃冰箱备用。

1.5 淀粉颗粒显微结构观察

采用Philips XL30ESEM环境扫描电镜对淀粉颗粒形态进行观察。首先进行样品的前处理，即将淀粉颗粒样品用无水乙醇单层分散于样品盘上，用IB-5离子溅射器(Eiko Co.，日本)处理30 min，镀一层Pt金离子，之后用环境扫描电镜将样品置于不同放大倍数下拍照。

1.6 淀粉X-ray晶型分析

X-射线衍射(X-ray powder diffraction，XRD)是研究晶体三维结构几何性质与分子本身性质最有用的技术之一。本试验材料的X-衍射图谱是利用多晶X-射线衍射仪(德国布鲁克AXS公司，D8-ADVANCE)得到的。淀粉样品在室温环境下平衡24 h后再进行分析。衍射仪操作参数为40 mA和45 kV，衍射角(2θ)的扫描范围为4°～40°，每0.2 s扫描0.1°。晶体峰和总的衍射面积通过机械极差求积法(mechanical polar planimeter)求得，结晶度用晶区面积占总面积的百分比表示。

1.7 淀粉傅里叶红外光谱分析(ATR-FTIR)

将淀粉粉末置于盛有饱和氯化钠水溶液的密闭容器中，吸水7 d处理，随后将样品加到OMNI采样器中，利用ATR支架，对淀粉样品进行全反射光谱扫描，扫描波数范围为 4 000～800 cm-1，分辨率为4 cm-1，采用DTGS检测器，以去离子水为空白扫背景，扫描累加64次。利用FTIR附带的软件分析波谱。首先选取波数为1 200～800 cm-1区域的谱图，调整基线，设置半峰宽为19 cm-1，增强因子为1.9对选取的波谱进行去卷积，获得去卷积波谱。利用Origin 6.0软件对波谱作图，测定1 047 cm-1、1 022 cm-1和995 cm-1各峰顶点到基线的高度(即峰强度)，计算1 045 cm-1/1 022 cm-1和1 022 cm-1/995 cm-1的峰强度比值。

2 结果与分析

2.1 BL处理对水稻萌发的影响

种子的萌发伴随着种子不断吸水，打破休眠的种子在鲜质量、萌发率、胚根胚芽等方面都有变化。种子的萌发总体而言可以分为3个阶段，第1个阶段(前20 h)为快速吸胀吸水阶段，表型上看不出明显变化；第2阶段(20～50 h)为代谢再激活阶段，各种代谢过程活化并伴随着胚芽鞘的出现和伸长；第3阶段(50 h以后)为另一个快速吸水的生长吸水阶段，伴随着胚根的出现[11]。为了检测在萌发过程中施加BL对水稻种子萌发的影响，分别用1 μmol/L的BL溶液和相应的DMSO对照溶液处理日本晴种子，从0 h到72 h，每隔12 h拍照记录萌发情况，至72 h已可明显观察到突出的胚根、胚芽鞘，此时进一步测量其长度。结果如图1所示，萌发前24 h 这2种处理的种子均无明显变化，36 h后种子的胚吸水胀大，胚芽鞘开始出现；随后胚芽鞘进一步突出伸长，至72 h种子的胚根出现，且总体而言DMSO对照溶液处理的胚根长度极显著长于BL处理组。测量萌发72 h种子的胚芽胚根，结果显示，BL处理与对照间胚芽的长度没有显著差异，但DMSO处理的胚根长度极显著长于BL处理，推测可能是因为 1 μmol/L 的BL相对于种子胚根而言浓度过高，对其伸长具有抑制效应。高浓度BL对根伸长的抑制效应在双子叶模式植物拟南芥中也有报道。Tanaka等研究显示1 μmol/L的BL促进拟南芥幼苗的下胚轴伸长，但显著抑制根的伸长，根的长度仅为对照组的30%左右[12]，本研究与其结果类似，说明根对BL处理更加敏感。

2.2 BL处理对几个淀粉合成关键基因表达的影响

为鉴定水稻种子萌发过程中BR对胚中蛋白表达的调控，进而解析BR调控种子萌发的分子机制，前期以BR合成抑制剂BRZ处理的日本晴种子及BR不敏感突变体d61种子为研究材料，利用iTRAQ蛋白组学的方法鉴定萌发种子胚中受BR调控的目标蛋白[13]。研究结果显示在受BR通路调控的目标蛋白中包括3个参与淀粉代谢的关键酶，分别为Wx、SBE1和AGPS2，且3个酶的表达在BR合成缺失和BR信号通路受损的水稻种子中均明显降低(图2-A)。之前笔者创建了一批淀粉合成关键基因启动子融合GUS报告基因的转基因水稻，其中正好包括Wx、SBE1和AGPS2的同工酶AGPS1。因此，利用这些水稻材料进一步研究BL处理如何影响这些基因在胚乳中的表达。GUS定量分析结果显示，总体而言Wx基因在萌发种子胚乳中的表达量最高，SBE1基因表达最低。BL处理与对照组的比较结果显示，BL明显抑制Wx基因的表达，仅为对照处理的50%左右；而BL对SBE1表达没有明显影响，但BL可明显诱导AGPS1基因的表达(图2-B)。通过比较本研究结果与之前的蛋白组学结果可知，抑制BR合成或信号传导可一致性降低这3个酶在胚中的表达，而胚乳中BL处理对这3个基因转录水平的调控则不同于之前的研究，AGPS1的表达明显上升，而Wx表达明显下降，SBE1表达变化不明显，推测可能是因为表达检测的组织不同(胚乳和胚)，研究表达调控的水平也不一样(转录水平和翻译水平)。该结果表明，在种子萌发过程中BR可在不同表达水平、不同组织中特异性地调控稻米淀粉代谢，其具体的分子机制还有待于进一步研究。

2.3 BL处理影响稻米淀粉的理化特性

上述结果已明确BR可通过调控淀粉代谢相关基因的表达来影响种子的萌发，本研究进一步从淀粉的理化性质层面分析BL处理对稻米淀粉代谢的影响。选取处于萌发第2阶段(36 h后)经BL和对照溶液处理的日本晴种子，利用改进的淀粉提取方法分别提取其胚乳中的淀粉，并进行环境扫描电镜(SEM)观察，以初步确定种子萌发初期BL处理对淀粉粒形态结构的影响。总体而言，BL处理的水稻种子近1/2淀粉颗粒表面仍比较光滑，其余淀粉颗粒表面已初步降解，形成较明显的孔洞；而对照组中，淀粉颗粒表面开始降解形成孔洞的比例要明显高于BL处理组(图3)，至少表明在种子萌发初期BL处理可以影响水稻胚乳中淀粉颗粒的降解速度。

为探究BL处理是否影响稻米淀粉的精细结构，进一步分析了2组材料中淀粉的结晶度和有序结构。淀粉颗粒结构包括结晶区和无定形区，其中结晶区主要是由支链淀粉分子以双螺旋结构组成，结构稳定，不易受外力破坏；无定形区由直链淀粉分子组成，结构较为松散，易为外力和化学组分破坏[14]。目前XRD技术是一种比较成熟的测定晶体类型并计算结晶度的方法，其操作易行，结果可靠。本研究的XRD结果如图4所示，供试样品的结晶度数据表明，BL处理样品的结晶度明显高于对照组(表1)。

用傅里叶红外光谱仪对淀粉的短程有序结构进行衰减全反射分析。通过设置增强因子对原始数据进行去卷积处理后得到图5。研究表明，波谱中1 045 cm-1/1 022 cm-1和 1 022 cm-1/995 cm-1峰强度比值被看作是淀粉有序结构的指标，其比值越大，有序程度越高 。计算结果如表1所示，结果显示BL处理样品的1 022 cm-1/995 cm-1峰强度比值显著高于对照样品。上述结果表明BL处理样品中淀粉保持着更好的结晶度和更加有序的结构，暗示在萌发过程中胚乳淀粉降解较慢，可能是导致萌发早期种子胚根生长较缓慢的原因之一。

表1 淀粉的相对结晶度和红外光谱特性

注：每个数值进行3次重复，数据为平均值±标准差；“**” 表示数值与对照组有极显著差异(P<0.01)；“*”表示数值与对照组有显著差异(P<0.05)。

3 讨论

研究种子萌发的调控机理、提高生产中种子的萌发率和萌发势一直是植物种子研究的重点。种子萌发过程受多种内在和外在因素的影响和调节，其中包括植物激素。BR是一种重要的甾醇类植物激素，参与植物生长发育诸多过程的调控。目前，对于BR的合成与降解、生理效应、参与环境胁迫的作用、信号传导通路的解析等研究均取得了显著进展，但关于BR调控植物种子萌发和幼苗形态建成的机理研究还较少，大部分分子机制仍然未知。

同时，淀粉作为重要作物水稻种子的最主要成分，其积累、组成和结构对稻米的产量和品质有着重要的影响。已有研究结果表明，BR参与了植物的淀粉代谢过程。在拟南芥中，BR合成基因CPD的反义转基因材料和BR合成缺陷型突变体cbb1叶片中的淀粉含量均显著下降[15]。Oh等研究结果显示，在BR不敏感型突变体bri1-5中过表达野生型和改造过的(Y831F)BR受体基因BRI1均能提高叶片中的淀粉含量[16]。除拟南芥外，其他植物中的相关研究也证明BR能够影响植物的淀粉代谢。在黄瓜中，外源喷施BR能够显著提高黄瓜叶片中蔗糖和淀粉的含量[17]。在水稻中，于抽穗前期及抽穗期喷施BR使得水稻叶鞘和茎秆中的淀粉含量有所减少，而种子中的淀粉含量有明显增加[18]。Wu等利用组织特异性启动子在水稻根、茎、叶中超表达来源于拟南芥、玉米和水稻的C-22 羟化酶基因来增加BR的合成，对转基因水稻的分析结果显示，水稻剑叶中葡萄糖含量提高，水稻种子中葡萄糖转化成淀粉的过程增强[19]。这些试验结果表明，BR确实能够影响植物的淀粉代谢过程，能促进植物叶片和种子中淀粉的积累。除了种子发育过程中涉及到淀粉的合成与积累，种子萌发过程中的淀粉代谢也是一个重要环节，但目前有关BR如何通过影响淀粉的代谢从而调控种子的萌发仍然未知。

本研究通过BR处理萌发阶段的种子，一方面研究BR对淀粉代谢过程中关键基因的表达调控，明确BR在种子胚和胚乳中对Wx、SBE1等目标基因具有不同的调控模式，进一步明确植物激素对植物生长发育的调控具有组织特异性，其潜在的调控机制也可能不同；另一方面，通过扫描电镜(SEM)观察、XRD波谱分析等方法研究了BR处理对稻米淀粉的降解速率、淀粉结晶度和有序结构的影响，表明BR在种子萌发初期发挥着作用，对淀粉的降解过程具有明显影响。该研究结果与Han等研究结果较为一致，其蛋白质组学研究结果表明，在水稻种子萌发初期，BR信号传导途径中BSK1、BSU1和BIN2这3个关键元件的磷酸化水平有了显著提高，表明在水稻种子萌发初期BR信号通路得到加强[20]。本研究相关结果为完善淀粉代谢的调控网络提供了重要信息，也为进一步解析水稻中BR调控种子萌发的分子机制奠定了基础。

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