肝细胞核因子1α基因rs7310409多态性与健康成人血清AFP水平显著相关

史瑞崎，邵冬华，何美琳，梁国威

(北京大学航天临床医学院 检验科，北京100049)

在遗传持续性甲胎蛋白(HPAFP) 家族中的研究显示，AFP基因上游200 bp启动子区域内的2个肝细胞核因子-1α(HNF1α)结合位点的碱基变异(-119G>A和-55C>A)是HPAFP者血清AFP非疾病性显著升高的原因[1,2]。这2个位点变异可导致HNF1α结合AFP启动子序列同源性的增加，增强HNF1α结合AFP基因启动子的能力，导致AFP基因转录活性增强，进而引起血清AFP水平显著持续升高。上述研究提示HNF1α在调控AFP基因表达中起着关键作用，也提示基因变异与血清AFP水平具有显著相关性。rs7310409(A/G)，位于HNF1α基因第1内含子内，是与人体多种复杂性状或疾病相关联的多态性位点。全基因组关联分析研究(GWAS)显示，rs7310409多态性与C-反应蛋白(CRP)[3]、谷氨酰氨基转移酶[4]和胰腺癌[5]皆具有显著相关性。我们推测rs7310409与血清AFP水平也具有显著相关性，并在616例汉族成年健康人中验证rs7310409与血清AFP水平的相关性。

1 对象与方法

1.1研究对象收集我院2017年1月至2017年8月健康体检人员资料。根据调查问卷和实验室检测指标，将患有急、慢性乙型、丙型病毒性肝炎(HBsAg抗原和HCV抗体阳性)、饮酒(男性≥140 g/周，女性≥70 g/周)、怀孕、肝癌和其它各种肿瘤的调查对象剔除。共计获得完整资料的调查对象616例(男性：407例，年龄范围：25-65 岁；女性：209例，年龄范围：25-65岁)。

1.2方法(1)临床基本资料调查：测量所有受试者身高、体重，并计算体质量指数(BMI)；血压取3次测量平均值；(2)实验室检查：使用真空采血管(美国BD公司提供)抽取空腹静脉血，血液离体2h内检测完毕。采用全自动生化分析仪(日本OLYMPUS公司AU 2700)测定甘油三脂(TG)、总胆固醇(TC)、高密度和低密度脂蛋白胆固醇(HDL-C和LDL-C)、空腹血糖(FPG)、CRP、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)，由日本OLYMPUS公司提供配套试剂。血清AFP测定采用美国雅培公司 i2000 免疫分析仪(USA) 进行检测，批内、批间变异系数(CV值)分别为3.5%-4.7%和4.1%-8.1%，由雅培公司提供配套试剂。

1.3非酒精性脂肪肝(NAFLD)诊断采用美国Philips公司(IU-22型)B型超声影像仪，行腹部B型超声进行诊断[6]。

1.4外周血基因组DNA提取EDTA抗凝外周全血200 μl用于基因组DNA提取，采用天根生化科技(北京)有限公司的血液、细胞、组织基因组DNA提取试剂盒，按试剂盒说明操作。提取后的基因组DNA -80℃冻存备用。

1.5rs7310409分型检测采用等位基因特异性引物(ARMS原理)结合TaqMan-MGB探针的荧光定量PCR方法(ARMS-TaqMan方法)进行检测[7]，根据ΔCt 值(ΔCt=A等位基因反应体系Ct值减去G等位基因反应体系Ct值)进行分型。引物和探针采用ABI 公司的TaqExpress 软件(Foster City,CA)进行设计(见表1)，由北京赛百盛基因技术有限公司和美国ABI公司合成。(1)ARMS-TaqMan法：扩增片段长度64bp，反应体系20 μl，其中基因组DNA 2 μl，2×Master mix 8 μl和Ehance inhibit 1 μl[天根生化科技(北京)有限公司提供]，上、下游引物各1 μl(终浓度0.25 μM)，TaqMan探针1 μl(0.25 μM)，水6 μl。反应条件为95℃ 2 min，95℃15 s、60℃ 1 min、(40个循环)。循环阈值(Ct值)设定在0.03，基线设定为自动设定基线，测定仪器为ABI 7500 荧光定量PCR仪(ABI公司，美国)。(2)测序：PCR扩增片段长度674 bp，按常规PCR条件扩增，北京诺赛基因组研究中心有限公司完成测序。

表1 rs7310409多态性ARMS-TaqMan分型测序法的引物和探针序列

注：A和G等位基因引物3′端-2位引入错配碱基A (原碱基为C)，以增加基因分型特异性。

2 结果

2.1rs7310409等位基因ARMS-TaqMan法分型检测结果

对616例研究对象采用ARMS-TaqMan方法进行基因分型检测，检出成功率100%，其中AA型的ΔCt=-13.06±1.25(107例)，AG型的ΔCt=0.30±0.48(298例)，GG型的ΔCt=13.6±1.21(211例)，等位基因分布频率符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=0.010,P=0.919)。A和G等位基因反应体系Ct值的变化情况见图1。

ARMS-TaqMan方法分型后随机选取AA型、AG型和GG型各3例，经直接测序证实100%符合。

2.2616例研究对象的基本资料

616例研究对象基本资料见表2，男、女组间的BMI、SBP、DBP、FBG、TC、TG、HDL-C、CRP和ALT存在显著差异(P<0.05)；年龄、LDL-C、AFP和NAFLD无显著性差异(P>0.05)；rs7310409等位基因型分布男、女间无显著性差异(P>0.05)。

图1 ARMS-TaqMan方法检测616例研究对象的A和G等位基因反应体系的Ct值散点图

表2 616例研究对象的基本资料

注：P值：男、女组间比较；SBP：收缩压；DBP：舒张压

2.3rs7310409等位基因型的血清AFP水平变化情况

血清AFP水平在AA型(107例)最低，为3.33 ± 1.57 ng/ml，AG型(298例)为3.59 ± 1.47 ng/ml，在GG型(211例)最高，为4.05 ± 1.91 ng/ml，3组间皆具有统计学差异(P=0.038～P<0.001)。与GG型比较，携带AA型健康人群的血清AFP水平的平均值下降17.8%，AG型下降11.4%。见图2。

2.4rs7310409等位基因型的血清AFP水平相关性分析

以AFP作为因变量，不同模型的线性回归(linear regression models)分析显示，无协变量，控制年龄和性别，以及控制年龄、性别、CRP、LDL-C、ALT、AST和 NAFLD后，皆显示rs7310409等位基因型与血清AFP水平显著相关(P<0.001)，见表3。

图2rs7310409等位基因型的血清AFP水平95%可信区间(95%CI)比较图。P值为AFP转化为自然对数后进行组间比较值。

表3 rs7310409等位基因型的血清AFP水平相关性分析

注：模型1：无矫正因子；模型2：控制年龄和性别；模型3：控制年龄、性别、CRP、LDL-C、ALT、AST和 NAFLD

3 讨论

本研究在中国汉族健康人群中，首次证实血清AFP水平与HNF1α基因rs7310409多态性具有显著相关性，其相关性不受性别、年龄、炎症指标CRP、血脂LDL-C、肝功指标ALT和AST以及脂肪肝的影响。与rs7310409 GG型比较，携带AA型的表观健康人群表现为血清AFP水平的平均值降低17.8%，而AG型降低了11.4%。

HNF1α属于肝细胞核因子家族，位于染色体12q24.31，在肝脏较多表达，是调节肝脏内基因特异性表达的转录因子。HNF1α可调控超过100多种基因表达，其中大部分潜在的调控结合位点都位于被调节基因的启动子区域，并与其它转录因子相互作用共同调控基因表达[8]。人AFP基因启动子位于5′端转录起始点上游-200 bp内，能与AFP启动子结合的反式作用因子包括肝细胞核因子、核因子、CAAT结合/增强子结合蛋白(C/CEP)和成熟肝细胞AFP启动子结合蛋白(NP)等[9]。其中，HNF1α和HNF1β基因翻译的蛋白通过识别AFP启动子Ⅰa和Ⅱ′区的5′-GTTAATNATTAAC-3′序列，并与其它蛋白形成同源或异源二聚体作用于该DNA序列增强AFP基因转录活性[8]。点突变方法证明HNF1α结合区之一Ⅱ′区突变时，导致约65%的AFP基因抑制，如Ⅰa区突变则导致约50%的AFP表达抑制，表明HNF1α基因及其结合区序列碱基变异对AFP基因表达起着重要作用[9]。

rs7310409多态性与血清AFP水平变化的确切机制有待于进一步的研究。rs7310409 位于HNF1α基因内含子1区，属于非编码核酸变异，根据国际人类基因组单体型计划Hap Map3中国汉族人群数据，rs7310409多态性与HNF1α基因的2个非同义编码的多态性位点rs1169288 (r2=0.741) 和rs2464196 (r2=0.633)存在显著连锁不平衡，这2个SNP位点变异可导致氨基酸改变，进而可能影响HNF1α翻译的蛋白活性，从而影响AFP基因表达，其确切机制有待于进一步研究。另外，rs7310409多态性与血清AFP水平相关也可能是rs7310409多态性与其它影响AFP基因表达的多态性、突变位点存在显著连锁不平衡所致。同时，近年来研究提示在许多疾病相关基因中位于内含子上的突变可影响pre-mRNA的剪接过程，最常见的剪接突变是通过产生或增强剪接位点或产生新的分支点而导致异常剪接[10,11]。因此，rs7310409位点变异可能影响HNF1α基因的mRNA的剪接过程，进而影响HNF1α翻译的蛋白质的活性，从而影响AFP基因表达，其确切机制有待于进一步研究。

根据Hap Map3数据，不同种族人群中rs7310409多态性的最小等位基因频率(MAF)分布具有显著差异。本研究中A等位基因的MAF=0.329，与欧洲人群的MAF=0.420和非洲人群的MAF=0.333频率基本相似，但与日本人群的MAF=0.535具有显著差异。因此，rs7310409多态性与血清AFP的相关性有待于在不同种族人群中进一步验证。

综上所述，本研究在中国汉族健康人群中发现HNF1α基因rs7310409多态性与血清AFP具有独立的显著相关性，携带AA型、AG型等位基因的健康人群皆表现为血清AFP水平显著降低。由于AFP不只是一个肿瘤特别是肝细胞癌的标志物，还与肝细胞癌的发生发展、预后，甚至基因治疗靶点有关[12,13]，因此，AFP表达变化的分子机制研究显得尤为重要，本研究为血清AFP水平变化提供了新的遗传决定因子。

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