刘 徽,蔡 琳,廖海燕
新面醑为第三军医大学第二附属医院生产的医院制剂,临床主要用于治疗寻常痤疮及头皮脂溢性皮炎等,为常见的皮肤科用药。其主要有效成分为甲硝唑、氯霉素、水杨酸,原《总后卫生部非标准制剂标准》采用容量分析方法测定水杨酸的含量,却未对甲硝唑和氯霉素含量做具体规定。为了实现对该制剂质量的更好监控,通过查阅相关文献资料[1-6],对甲硝唑和氯霉素含量测定方法,采用高效液相色谱(HPLC)法居多,笔者探讨了采用HPLC法同时检测甲硝唑、氯霉素、水杨酸含量的方法,供同仁参考。
1.1 仪器 高效液相色谱仪(岛津,日本),优普系列超纯水器(型号:UPT-Ⅰ,生产厂家:成都超纯科技有限公司),超声波清洗器(型号:KQ5200E,生产厂家:昆山市超声仪器有限公司),电子分析天平(型号:BT25S,生产厂家:赛多利斯)。
1.2 试药 甲硝唑对照品(中国食品药品检定研究院,纯度 99.9%,批号:100191-201507),氯霉素对照品(中国药品生物制品检定所,纯度99.4%,批号:130555-201203),水杨酸对照品(中国食品药品检定研究院,100106-201104,纯度:99.9%),甲醇(成都科龙化工试剂厂,批号:2013120401),磷酸(成都科龙化工试剂厂:批号:20130413),色谱甲醇(A455-4,飞世尔,美国),超纯水(自制),新面醑(第三军医大学第二附属医院生产,批号:170207、170219、170316)。
2.1 溶液制备
2.1.1 对照品溶液制备 取甲硝唑、氯霉素、水杨酸对照品适量,加流动相制成每1 ml分别含甲硝唑0.1mg、氯霉素0.1mg、水杨酸0.0125mg的溶液,混合后作为对照品溶液。
2.1.2 供试品溶液制备 取新面醑2ml,置200ml量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀,过滤,取续滤液作为供试品溶液。
2.1.3 阴性对照溶液 按照处方,分别加入除甲硝唑、氯霉素和水杨酸以外的其他成分,制备阴性样品100ml,按照“2.1.2”制备方法制成阴性对照溶液。
2.2 色谱条件 色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱 Inertsustain C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:甲醇 -水(55∶45)(pH3.2),检测波长 230 nm;柱温 35℃,进样量:10 μl。
2.3 方法学考察
2.3.1 专属性实验 按照上述色谱条件进样对照品溶液、供试品溶液及阴性对照品溶液各10μl,3组分出峰顺序依次为甲硝唑、氯霉素、水杨酸(图1)。3组分保留时间分别为4.4、7.0、10.0min,分离度分别为1.8、3.2、3.9,分离度均符合规定。结果显示阴性对照溶液在主峰位置无色谱峰,专属性良好。
2.3.2 线性关系考察 采用上述方法分别进样对照品溶液各 2、4、8、10、12、20 μl,记录色谱图。 以峰面积(A)对进样浓度 C(μg/ml)进行线性回归,得甲硝唑线性方程为:A=14956C+5142(n=6),r=0.9999;氯霉素线性方程为:A=10343C+3288.5(n=6),r=1;水杨酸线性回归方程为:A=36578C-845.65(n=6),r=1。结果表明:甲硝唑、氯霉素、水杨酸分别在21.78~217.78 μg/ml、20.48~204.76 μg/ml、5.01~50.15 μg/ml范围内,与峰面积呈现良好的线性关系。
2.3.3 精密度实验 取“2.1.1”项下对照品溶液,按照上述色谱条件依次连续进样5次,记录色谱图,计算各组分峰面积的RSD,结果分别为0.4%(n=5)、0.6%(n=5)、0.7%(n=5),表明该方法精密度实验良好。
2.3.4 重现性实验 取批号为170207供试品2ml,精密量取,分别置6个 200 ml量瓶中,按“2.1.2”处理制成供试品溶液,按照上述色谱条件依次进样,记录色谱图,计算3组分峰面积RSD分别为0.5%(n=6)、0.7%(n=6)、0.8%(n=6), 表明方法重现性实验良好。
2.3.5 重复性实验 取批号为170207供试品2ml,照“2.1.2”处理得供试品溶液,室温下存放,依次在同一天内第 0、2、4、8、12、16、20、24 h 进样分析,分别记录3组分峰面积,计算3组分含量RSD分别为 0.6%(n=8)、0.7%(n=8)、0.9%(n=8),结果表明供试品溶液中3组分在24 h内稳定。
2.3.6 加样回收率实验 精密吸取批号为170207供试品1 ml(含甲硝唑、氯霉素、水杨酸分别为:10.02 mg/ml、10.04 mg/ml、2.52 mg/ml)各 9 份,分别置9个200ml量瓶中,再精密称取甲硝唑、氯霉素、水杨酸对照品适量,分别按已测出供试品含量的80%、100%、120%各 3份投于上述量瓶中,按“2.1.2”方法制备成供试品溶液,按上述色谱条件分别进样10μl,记录3组分峰面积和各对照品加入量,计算各组分平均回收率及相对标准平均偏差,结果见表1。
2.4 样品含量测定 取甲硝唑、氯霉素、水杨酸对照品适量,精密称定;取3个批号的新面醑为样品,按照“2.1.1”和“2.1.2”项下制成对照品溶液和供试品溶液,对照品溶液平行制备2份,供试品每批次平行制备3份,按照上述色谱条件依次进样,记录3组分峰面积,按外标法计算3组分含量,求平均含量和相对标准平均偏差(RSD)。 结果见表2。
表1 新面醑中甲硝唑、氯霉素、水杨酸回收率结果(n=9)
表2 新面醑中甲硝唑、氯霉素、水杨酸含量测定结果及RSD(mg/mI)
检测波长的确定:本研究采用SPD-M20A二极管阵列检测器,通过对3组分进行全波长扫描检测,水杨酸在230 nm处的吸光度最高,甲硝唑和氯霉素在此波长也存在吸收,且根据处方得知,水杨酸处方量较少,故采用230 nm作为3组分的共同检测波长。
图1 高效液相色谱图
原标准在对该品种进行质量控制时,只是采用容量分析方法对水杨酸进行含量测定,显然已不能满足最新药典的要求,为了患者用药安全,本研究建立HPLC法对该品种3组分进行全面质量控制,探索通过一种色谱条件同时测定该品种中3组分含量的方法。通过对方法的精密度、重复性、回收率等参数进行研究,结果表明,HPLC法测定本品时的精密度、重复性、回收率均良好,故该分析方法可以作为同时测定新面醑中3个主要成分含量的测定方法,为建立质量标准提供参考依据。
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