乳酸克鲁维酵母Kluyveromyces lactics整细胞催化苯乙酮制备(R)-1-苯乙醇工艺研究

曹 纲 郑美娟 郭金玲 田毅红 吕育财 余华顺 姚 鹃 龚大春

(1. 三峡大学 生物催化重点实验室, 湖北 宜昌 443002； 2. 安琪酵母股份有限公司 酶制剂事业部， 湖北 宜昌 443002)

手性(R)-1-苯乙醇及其衍生物不仅是合成很多如(R)-沙丁胺醇、(R)-托莫西汀等手性药物的中间体，而且也是重要的手性砌块，广泛应用于精细化学品、天然产品等合成中[1-2]．目前，合成(R)-1-苯乙醇的方法主要有化学不对称法、生物拆分、酶催化和整细胞催化4种方法．化学不对称合成方法因为其催化剂价格昂贵，光学选择性低，底物转化率在49%～64%之间，很难满足市场要求[3-4]．生物拆分有手性试剂拆分[5]、酶法拆分[6]和整细胞拆分[7]，手性拆分剂价格和酶制剂昂贵，拆分工艺复杂，转化率最多达到50%．而酶催化[8-10]和整细胞催化[11-12]制备(R)-1-苯乙醇已经成为主要方法，具有成本低、原子经济、立体选择性高等优点．整细胞催化与酶催化相比具有操作简单，不用添加辅酶等优势．目前主要是采用假丝酵母[13]和解脂耶氏酵母[14]，但存在细胞生长慢、底物容量小(100 mmol/L以下)、制备效率偏低等问题．

本文根据乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactics)具有营养简单、生长快、分泌蛋白能力强、不产生内毒素和对人类安全[15]等优点，用于苯乙酮的生物转化．拟通过单因素和正交实验，研究Kluyveromyceslactics整细胞催化苯乙酮制备(R)-1-苯乙醇的工艺，期望能提高苯乙酮的底物容量和转化率，为绿色生物加工放大提供一定的参考．

1 材料与主要仪器

1.1 菌种

Kluyveromyceslactics，实验室保藏菌种，培养温度：25～30℃．

1.2 种子培养基

活化YPD培养基(g/L)为葡萄糖10，蛋白胨10，酵母浸粉5;斜面培养基(g/L)为葡萄糖10，蛋白胨10，酵母浸粉5，琼脂粉20．

1.3 基础培养基

转化苯乙酮的基础培养基(g/L)：酵母浸粉10，蔗糖24，磷酸二氢钾1.5，七水合硫酸镁1.0．

1.4 主要仪器

高效液相色谱仪LC5090(福立仪器有限公司)；旋转蒸发器RE-52A4(上海亚荣生仪器厂)；CHIRALCEL OB-H手性柱 Particle Size：5 μm，Dimensions:Φ4.6 mm×250 mm．

2 实验方法

2.1 Kluyveromyces lactics生长培养基优化

2.1.1 碳源优化

选择葡萄糖、乳糖等5种主要碳源，以各种碳源含碳量为基础，按照等摩尔碳使用量原则进行设计，其他培养基不变，搅拌转速为100 rmp，培养温度为30℃，采用表1进行试验，发酵24 h后，测定实际菌体重量，确定Kluyveromyceslactics生长所需要的最佳碳源．

表1 碳源添加量对克鲁维乳酸酵母生长的影响(单位：g/L)

2.1.2 氮源优化

选用优化的碳源种类和用量，其他培养条件不变，选择酵母浸膏、牛肉膏等6种氮源按照表2进行试验，确定Kluyveromyceslactics生长所需要的最佳氮源．

表2 不同氮源添加量对克鲁维乳酸酵母生长的影响(单位：g/L)

2.1.3 克鲁维乳酸酵母的生长曲线

根据最佳碳源和氮源，测定乳酸克鲁维酵母的生长曲线，了解其对数生长期，为生物催化添加底物时间提供依据．

在这方面，北海市2010年制定了《北海市建筑市场信用管理办法》，并编制了配套使用的《不良行为和良好行为记录认定标准》，对在北海市从事建筑活动的施工、监理单位和从业人员给予日常行为记分，每年初根据上三年的行为进行一次综合信用评价分级。把评价结果量化为企业投标得分，使建筑企业施工现场的表现和建筑市场的招投标市场竞争力有效地结合起来，实现了“两场联动”，促使企业不再重投标、轻工程管理。有利于信誉良好、实力雄厚、施工现场管理表现好的企业中标，有利于引导建筑业企业注重标后管理，逐步形成“守信者荣、失信者耻、无信者忧”的社会氛围，从而推动北海市建筑业的发展和工程建设水平的提高。

2.2 克鲁维乳酸酵母整细胞催化工艺优化

2.2.1 不同催化方式的比较研究

为了研究苯乙酮的生物催化工艺，选取先培养24 h后静息催化、分别培养10 h和18 h后一次添加苯乙酮催化3种方式进行试验，100 mL培养液中苯乙酮总添加量为3 g，浓度为249 mmol/L(添加前用少量正己烷溶解)，催化转化12 h后，用正己烷萃取，分液后，取有机层，用无水硫酸钠干燥，过滤，旋转蒸发后，用甲醇(色谱纯)定容，采用高效液相和手性柱测定(R)-1-苯乙醇化学收率和光学收率，确定最适宜催化方式．

2.2.2 整细胞催化工艺优化

选取最适宜催化方式，选取碳源、氮源、补料方式等5因素4水平进行16次正交试验(见表3)，整细胞催化24 h．为了保证菌体具有一定的通透性，试验中添加了少量十二烷基磺酸钠．采用2.2.1的后续处理方法，进行(R)-1-苯乙醇化学收率和光学收率测定，并采用正交分析软件，以(R)-1-苯乙醇产率为目标，确定最佳催化工艺条件．

表3 苯乙酮整细胞催化五因素四水平表设计

表4 苯乙酮整细胞催化L16(45)正交实验表设计

注：A1～A4根据最佳碳源种类和最大菌浓对应的量进行设计；B1～B4根据最大氮源和最大菌浓对应的量进行设计，E1～E4分别代表在菌体生长对数期后一次添加底物、每隔6 h 2次添加底物、每隔4 h 3次添加底物、每隔2 h 6次添加底物．

通过正交实验直观分析和方差分析，确定最佳整细胞催化工艺条件和显著影响因素．

2.3 (R)-1-苯乙醇光学纯度和产率的测定

将转化的发酵液采用2.2.1的方法处理，定容后，利用高效液相色谱仪CHIRALCEL OB-H手性柱，流动相为正己烷∶异丙醇=9∶1，柱温：30℃条件下，采用外标法测定(R)-1-苯乙醇的化学收率和光学收率，紫外检测波长为254 nm，进样量为10 μL．

苯乙酮标准品的保留时间为9.485 min，(R)-1-苯乙醇的保留时间为6.908 min，(S)-1-苯乙醇的保留时间为11.816 min(如图1所示)．

图1 苯乙酮、苯乙醇的HPLC图谱

(R)-1-苯乙醇的光学收率=

3 结果与讨论

3.1 乳酸克鲁维酵母生长特性研究

3.1.1 碳源的优化

按照2.1.1的方法，采用葡萄糖、蔗糖等5种碳源，在不同浓度下进行试验．结果如图2所示．

图2 不同碳源对乳酸克鲁维酵母生长影响

实验表明，Kluyveromyceslactics在木糖中生长最慢，而对二糖乳糖、蔗糖利用较好，其中在蔗糖中生长最快，因此蔗糖是Kluyveromyceslactics生长的最佳碳源．在蔗糖用量为23.8 g/L时，菌体干重最大，菌体浓度最高，再增加蔗糖用量，会导致菌体生长的渗透压过高，不利于菌体生长，其菌体浓度反而下降，同时也会带来更多残糖剩余，不环保也不经济．

3.1.2 氮源的优化

按照2.1.2的方法，采用酵母浸膏、牛肉膏等6种氮源选用不同浓度，固定蔗糖为23.8 g/L的条件下进行试验，结果如图3所示．试验表明：Kluyveromyceslactics对硫酸铵和尿素等无机氮利用很缓慢，而对酵母浸粉和酵母浸膏利用较好，牛肉膏和蛋白胨次之．通过优化，在酵母浸粉10 g/L条件下，菌体浓度最高，再增加用量，残氮会增加，菌体浓度增加缓慢．

图3 不同氮源对乳酸克鲁维酵母生长影响

3.1.3Kluyveromyceslactics生长曲线的测定

在蔗糖23.8 g/L，氮源酵母浸粉10 g/L，磷酸二氢钾2 g/L，七水合硫酸镁1.5 g/L的条件下，30℃培养，每隔2 h测定一次菌体干重，绘制生长曲线．结果表明：乳酸克鲁维酵母在10 h之前生长较慢，10 h后进入对数生长期，在18 h菌体浓度达到最大，进入平台期(如图4所示)．本曲线测定为整细胞催化工艺提供依据．

图4 乳酸克鲁维酵母Kluyveromyces lactics生长曲线

3.2 不同催化方式的比较研究

为了研究乳酸克鲁维酵母Kluyveromyceslactics对苯乙酮的催化能力，按照2.2.1的方法对苯乙酮的生物催化方式进行了研究，结果见表5．实验表明，两种方式对苯乙酮整细胞催化后产生的(R)-1-苯乙醇的光学收率影响不大，但(R)-1-苯乙醇化学收率有较大差异，边培养边添加苯乙酮进行整细胞催化收率比静息细胞催化提高38.5%，在酵母对数生长期后期18 h时一次添加比在10 h对数生长前期加入好，可提高25%的产率．因此，后续工艺优化实验采用18 h后添加苯乙酮的整细胞催化方式．

表5 不同催化方式对苯乙酮的乳酸克鲁维酵母整细胞催化的影响

3.3 苯乙酮的整细胞动态催化工艺优化

按照2.2.2的方法，按照分批添加底物苯乙酮的方法，底物苯乙酮总容量不变，保持在249 mmol/L．利用Kluyveromyceslactics进行5因素4水平的正交实验优化，结果见表6．

表6 苯乙酮的乳酸克鲁维酵母正交试验结果

根据以上正交实验数据，结合直观分析表，可知5个因素对结果的影响大小顺序为：E>A>B>C>D，苯乙酮添加方式对结果影响最大，方差分析显示，碳源用量和苯乙酮添加方式为显著性影响因素，F比值分别为11.165和22.468，大于F临界=9.28(a=0.05)．Kluyveromyceslactics动态催化苯乙酮制取(R)-1-苯乙醇的最优工艺为A2、B3、C1、D2、E3，即蔗糖23.0 g/L，酵母浸粉10.0 g/L，磷酸二氢钾2.0 g/L，七水合硫酸镁1.50 g/L，培养18 h后每隔4 h添加一次底物，催化效果最好．通过分批添加，有效减少了苯乙酮对酵母细胞的毒性，提高了转化率．

3.4 转化苯乙酮效率的验证试验

在最优的整细胞催化工艺条件下，苯乙酮的容量为249 mmol/L，在蔗糖23.0 g/L，酵母浸粉10.0 g/L，磷酸二氢钾2.0 g/L，七水合硫酸镁1.50 g/L，培养18 h后，每隔4 h添加一次底物，整细胞催化(R)-1-苯乙醇化学收率可以达到95%，光学收率为99.5%，是目前利用酵母整细胞催化制备(R)-1-苯乙醇效果最好的方法．研究发现，如果进一步提高底物浓度至300 mmol/L时，由于细胞耐受度有限，化学收率会有一定程度下降，只能达到70%左右．

4 结 论

在充分研究乳酸克鲁维酵母Kluyveromyceslactics生长特性的基础上，对苯乙酮制备(R)-1-苯乙醇的整细胞催化工艺进行了研究．结果表明，乳酸克鲁维酵母Kluyveromyceslactics培养18 h后添加苯乙酮细胞催化比静息细胞催化效率高38.5%，在5因素4水平的优化条件下，采用蔗糖23.0 g/L，酵母浸粉10.0 g/L，磷酸二氢钾2.0 g/L，七水合硫酸镁1.50 g/L，培养18 h后每隔4 h添加一次苯乙酮，苯乙酮的容量控制为249 mmol/L，30℃条件下生物催化24 h得到的(R)-1-苯乙醇化学收率最高，可以达到95%，光学收率达到99.5%，是目前酵母细胞催化装载浓度最高的(R)-1-苯乙醇制备方法，具有一定的应用前景．后期要进一步通过微生物育种，提升底物耐受力，不断提高底物容量，并保证催化效率90%以上，使该工艺更加具有经济性．

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