NEDD8共价修饰抑制因子MLN4924对人卵巢癌细胞株SKOV3增殖和凋亡的影响①

刘 健 吴会芳 赵亚伟 张纪岩

(广西医科大学,南宁 530021)

神经前体细胞发育相关受控表达分子8(Neural precursor cell-expressed developmentally down regulat-ed 8，NEDD8 )是一种类泛素化样蛋白，与泛素最为接近[1,2]。NEDD8与底物蛋白共价结合的过程称之为NEDD8共价修饰(Neddylation)，有着调节底物蛋白稳定性、亚细胞定位和活性的作用。与泛素化修饰相同，NEDD8共价修饰需要酶1(Enzyme1，E1)、酶2(Enzyme2，E2)、酶3(Enzyme3，E3)的连续催化[3]，最终完成NEDD8分子与底物蛋白分子的共价结合。鉴定最清楚的NEDD8修饰底物是Cullins，Cullins是一类重要的泛素化修饰E3复合物中的关键组分，通过降解P-IκBα等机制促进细胞存活与增殖。MLN4924是一种小分子化合物，能够特异性地与NEDD8活化酶E1结合，从而抑制NEDD8共价修饰的发生。大量研究报道揭示，NEDD8活化酶E1有希望成为抗肿瘤药物的新靶点，而MLN4924作为NEDD8修饰的特异性抑制剂，可以抑制结肠癌、肺癌、多发性骨髓癌等多种肿瘤细胞的恶性生长[4-6]，有望成为新型抗肿瘤药物。

近年来，我国卵巢癌的发病率正在逐年上升，且趋于年轻化，成为第二大危害女性健康的恶性肿瘤，是我国肿瘤治疗的重点之一。目前，随着我国医疗水平的提高，虽然很多患者的症状可以在早期就被发现并给予治疗，使患者生存期大大延长，但依然存有很高的死亡率，严重威胁女性的身心健康。MLN4924对卵巢癌细胞恶性生长的影响及机制还不清楚，本文以不同浓度的MLN4924作用于人卵巢癌细胞株SKOV3，通过CCK-8法及Annexin V-APC/PI双染等方法观察其对细胞增殖和凋亡的影响，并探讨其可能机制[7,8]，进而为临床应用提供一定的理论依据，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂 MLN4924，美国Active Biochen公司；胎牛血清，美国HyClone公司；AnnexinV-APC/PI试剂盒，美国BioLegend公司；RIPA裂解液、蛋白定量试剂盒，北京天根生物公司；山羊抗兔NEDD8抗体，英国Abcam公司；山羊抗兔P-IκBα和HER2抗体，美国Cell Signaling公司；山羊抗兔PAR3抗体，中国爱必信公司；山羊抗鼠β-actin抗体，美国Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠和山羊抗兔IgG二抗，北京中杉金桥公司；CCK-8试剂盒，碧云天公司；ECL和人IL-6 ELISA试剂盒，美国Thermo公司；X光片、显影液、定影液，美国Kodak公司。

1.1.2仪器设备 CO2培养箱、低温高速冷冻离心机，美国Thermo公司；酶标仪，瑞士Tecan sunrise公司；紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；FACS Calibur型流式细胞仪，美国BD公司。SDS-PAGE蛋白电泳及转印，美国Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 人卵巢癌细胞株SKOV3，本实验室保种存放。由含10%胎牛血清的DMEM培养基，于37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞融合度生长至80%左右，0.25%胰酶消化、计数、传代。1.2.2CCK8法检测细胞存活 取对数生长期的SKOV3细胞，以每孔5×103细胞接种于96孔板，置于37℃、5%CO2培养箱中待细胞贴壁后，分别加入MLN4924 0、0.125、0.25和0.5 μmol/L处理72 h，每组设4个复孔。72 h后，每孔直接加入1/10体积的Cell Counting Kit 8(CCK8)，充分混合，保证孔中蓝色均一性，但避免产生气泡。于37℃培养箱中培养1 h至颜色变为橙色，在酶标仪450 nm波长处读取吸光度(A450 nm)值。细胞增殖抑制率(%)=(1-药物组A450 nm/对照组A450 nm)×100%。

1.2.3Western蛋白印迹法检测蛋白表达水平 使用不同浓度MLN4924 0、0.125、0.25和0.5 μmol/L处理24孔板内生长良好的SKOV3细胞4 h后，用预冷的PBS 1 ml/孔洗涤细胞一次，每孔加80 μl RIPA裂解液，用细胞刮在冰上迅速刮下，吸取裂解液至预冷的1.5 ml EP管中，冰上裂解15 min，再4℃离心机，13 000 r/min离心15 min，吸取上清至新的预冷1.5 ml EP管中，利用蛋白定量试剂盒调整蛋白浓度一致。加入4×SDS上样缓冲液，100℃沸水煮10 min，6 000 r/min离心30 s，弹匀。SDS-PAGE电泳，60 V恒压转印3 h冰浴电转至PVDF膜，5%脱脂牛奶的TBST室温封闭1 h后，加入一抗(PAR3、HER2、NEDD8、P-IκBα、β-Actin)4℃过夜，次日TBST洗涤10 min×3遍后加二抗室温孵育1 h，TBST洗涤10 min×3遍后，于暗室加入ECL发光显影。

1.2.4ELISA法测定IL-6的表达情况 将生长良好的SKOV3细胞用0.25%的胰蛋白酶消化，用DMEM培养基重悬细胞，以每孔5×104细胞接种于24孔板。置于37℃、5%CO2培养箱中待细胞贴壁，分别加入MLN4924 0、0.125、0.25和0.5 μmol/L处理4 h，每组设两个复孔，4 h时取培养基上清，按照ELISA试剂盒说明操作检测，在酶标仪450 nm波长处读取吸光度，测定其OD A450 nm值，使用prism软件计算分析。

1.2.5流式细胞仪分析细胞周期 处理方法同上述1.2.4，培养72 h后用0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，PBS洗涤两遍弃上清，70%乙醇4℃固定过夜，与RNaseA在37℃下共培养30 min后用PI避光染色10～15 min后，立即用流式细胞仪测定细胞周期。实验重复3次。

1.2.6流式细胞仪检测细胞凋亡 处理方法同上述1.2.4，培养72 h后用0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，PBS洗涤一遍弃上清，Annexin V Buffer洗涤并重悬，按照试剂盒说明分别加入Annexin V-APC/PI抗体，避光染色15 min后，立即用流式细胞仪测定细胞凋亡率。实验重复3次。

2 结果

2.1MLN4924对SKOV3细胞增殖的抑制作用 MLN4924在0.125、0.25和0.5 μmol/L的浓度下对SKOV3细胞作用72 h时，对细胞增殖有明显的抑制作用，并且随着剂量的加大，抑制效果也显著提高，在0.125、0.25和0.5 μmol/L的浓度下，细胞增殖抑制率分别达到了5%、32%和41%，见图1。

2.2MLN4924通过诱导P-IκBα积聚抑制IL-6表达 已有研究表明，自分泌的IL-6促进HER2阳性肿瘤细胞恶性生长，而NF-κB、PAR3和HER2是这些细胞中调控IL-6表达的关键机制[9-12]。分别加入MLN4924 0、0.125、0.25和0.5 μmol/L处理SKOV3细胞4 h后，0.25和0.5 μmol/L组细胞培养上清中IL-6分泌下降(图2)。同样条件下，将细胞裂解，Western blot检测PAR3、HER2、Neddylated-cullins、P-IκBα的表达水平。发现P-IκBα随MLN4924剂量的升高而积聚，NEDD8共价修饰的Cullins蛋白量明显降低，而PAR3、HER2表达水平变化不显著(图3)。提示MLN4924诱导P-IκBα积聚，IκBα降解减少，NF-κB入核减少，导致IL-6表达下降。

2.3MLN4924对SKOV3细胞周期的影响 由图4和表1可以看出，SKOV3细胞经不同浓度MLN4924刺激72 h后，加药组S期细胞百分比相较于对照组明显升高，表明MLN4924诱导细胞S期阻滞，且MLN4924 剂量在0.25和0.5 μmol/L时，可以看到形成了大量的四倍体细胞，使之没有完整的细胞周期，从而抑制细胞增殖。

图1 MLN4924对SKOV3细胞增殖的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of MLN4924 on proliferation of SKOV3 cells(±s，n=4)Note:Compared with control (0 μmol/L) group,*.P<0.05，**.P<0.01.

图2 MLN4924对SKOV3细胞分泌IL-6的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of MLN4924 on secretion of IL-6 by SKOV3 cells

图3 MLN4924对SKOV3细胞PAR3、P-IκBα、neddylated-cullins、HER2表达的影响Fig.3 Effect of MLN4924 on PAR3,P-IκBα，neddylated-cullins，HER2 expression in SKOV3 cellsNote:Lanes 1-5.MLN4924 0，0.125，0.25,0.5，1 μmol/L，respectively.

图4 MLN4924对SKOV3细胞周期的影响Fig.4 Effect of MLN4924 on cell cycle of SKOV3 cellsNote:A-D.MLN4924 0,0.125,0.25 or 0.5 μmol/L treatment for 72 h,respectively.

MLN4924(μmol/L)Diploid%G0+G1/%S/%G2+M/%Tetraploid%G0+G1/%S/%G2+M/%Apoptosis/%010071 14±0 2 18 88±0 49 98±0 402 78±0 30 125100037 91±1 31) 29 05±0 61)33 04±0 74 20±0 90 2534 92±0 365 08±0 31)30 94±2 51) 61 06±2 51)8±0 164 2±0 0524 31±0 611 49±0 6 6 23±0 51)0 5 6 2±2 5 93 8±2 51)19 9±9 91) 72 1±9 91)8±0 139 55±1 3 44 93±1 615 52±0 4 30 90±0 81)

Note：Compared with control (0 μmol/L) group，1)P<0.01.

图5 MLN4924对SKOV3细胞凋亡的影响Fig.5 Effect of MLN4924 on apoptosis of SKOV3 cellsNote:A-D.MLN4924 0,0.125,0.25 or 0.5 μmol/L treatment for 72 h,respectively.

2.4MLN4924对SKOV3细胞凋亡的影响 用浓度为0、0.125、0.25和0.5 μmol/L的MLN4924处理SKOV3细胞72 h后，流式细胞仪检测细胞凋亡率，加药组与对照组相比较发现，随着MLN4924浓度的增加，细胞凋亡率也明显提升，并且具有统计学意义(P<0.05)。表明MLN4924能够诱导细胞凋亡，从而抑制细胞增殖(表1、图5)。

3 讨论

本研究结果显示，MLN4924在体外对SKOV3细胞增殖具有明显的抑制作用。SKOV3细胞是HER2阳性肿瘤细胞，这类细胞的恶性生长往往依赖于IL-6的自分泌，而NF-κB，PAR3和HER2是调控IL-6表达分泌的关键机制[9-12]。为了研究MLN4924对卵巢癌细胞增殖抑制的作用机制，我们用Western blot检测了PAR3、HER2、Neddylated-cullins、P-IκBα的表达，同时检测IL-6的分泌情况。我们的结果提示MLN4924处理导致P-IκBα积聚，IκBα降解减少，NF-κB入核减少，所以导致了IL-6表达下降[13,14]。

细胞的增殖依赖于细胞周期的运行，而肿瘤治疗的中心环节就是干扰肿瘤细胞的细胞周期，从而使肿瘤细胞增殖速率减慢或诱导肿瘤细胞走向死亡。我们还分析了不同浓度MLN4924处理后，MLN4924对SKOV3细胞周期和细胞凋亡影响的研究。实验结果表明，MLN4924诱导细胞S期阻滞，且MLN4924剂量在0.25和0.5 μmol/L时，形成了大量的四倍体细胞，使之没有完整的细胞周期，同时细胞凋亡率明显升高，从而抑制细胞增殖[15]。

P-IκBα积聚、IL-6自分泌的下降可以部分解释MLN4924对SKOV3细胞增殖的抑制作用和凋亡效应。但是细胞S期阻滞，特别是大量的四倍体细胞的形成，无法用这一机制来解释。显然，MLN4924利用多种机制抑制卵巢癌细胞的恶性生长。

总之，本实验从细胞水平阐述了MLN4924对卵巢癌细胞SKOV3增殖的抑制作用，为其用于卵巢癌的临床治疗提供了一定的理论依据，下一步将从具体的分子机制、与现有化疗药物之间的协同效应等方面进行实验，并进一步评价MLN4924对卵巢癌发生发展的抑制作用及其安全性。

[1] Kim W,Bennett EJ,Huttlin EL,etal.Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome[J].Mol Cell,2011,44(21):325-340.

[2] Burroughs AM,Balaji S,Lyer LM,etal.Small but versatile:the extraordinary functional and structural diversity of the beta-grasp fold[J].Biol Direct,2007,2(18)：1-28.

[3] Soucy TA,Smith PG,Milhollen MA,etal.An inhibitor of NEDD8-activating enzyme as a new approach to treat cancer[J].Nature,2009,458(7239):732-736.

[4] Lin JJ,Milhollen MA,Smith PG,etal.NEDD8-targeting drug MLN4924 elicits DNA rereplication by stabilizing Cdt1 in S phase,triggering checkpoint activation,apoptosis,and senescence in cancer cells[J].Cancer Res,2010,70(24):10310-10320.

[5] Milhollen MA,Narayanan U,Soucy TA,etal.Inhibition of NEDD8-activating enzyme induces rereplication and apoptosis in human tumor cells consistent with deregulating CDT1 turnover[J].Cancer Res,2011,71(8):3042-3051.

[6] Swords RT,Kelly KR,Smith PG,etal.Inhibition of NEDD8-activating enzyme:a novel approach for the treatment of acute myeloid leukemia[J].Blood,2010,115(33):3796-3800.

[7] 钟秀宏，赵丽微，赵芬琴,等.桦褐孔菌醇诱导人卵巢癌SKOV3 细胞株凋亡及其分子机制研究[J].中国药学杂志，2014,49(3):191-194.

Zhong XH,Zhao LW,Zhao FQ,etal.Effect of inotodiol on cell proliferation and apptosis of human ovary cancer cell line SKOV3 and its molecular mechanism[J].China Pharm J,2014,49(3):191-194.

[8] 马湘一,王世宣,刘 琰,等.雷帕霉素联合紫杉醇诱导卵巢癌细胞A2780和SKOV3 凋亡及其分子机制[J].癌症,2007,26(4):367-370.

Ma XY,Wnag SX,Liu Y,etal.Induction effect of rapamycin combined paclitaxel on apoptosis of ovarian cancer cells lines A2780 and SKOV3 and the molecular mechanism[J].Clin J Cancer,2007,26(4):367-370.

[9] Jin S,Mutvei AP,Chivukula IV，etal.Non-canonical Notch signaling activates IL-6/JAK/STAT signaling in breast tumor cells and is controlled by p53 and IKK/IKK[J].Oncogene,2013，32(41):4892-4902.

[10] Guyer RA and Macara IG.Loss of the polarity protein PAR3 activates STAT3 signaling via atypical protein kinase C (aPKC)/NF-B/interleukin-6 (IL-6) axis in mouse mammary cells[J].J Biol Chem,2015，290(13):8457-8468.

[11] Huang WC,Hung CM,Wei CT，etal.Interleukin-6 expression contributes to lapatinib resistance through maintenance of stemness property in HER2-positive breast cancer cells[J].Oncotarget,2016，7(38):62352-62363.

[12] Hartman ZC,Yang XY,Glass O，etal.HER2 overexpression elicits a proinflammatory IL-6 autocrine signaling loop that is critical for tumorigenesis[J].Cancer Res,2011，71(13):4380-4391.

[13] Read MA,Brownell JE,Gladysheva TB，etal.NEDD8 modification of cul-1 activates SCF(beta(TrCP))-dependent ubiquitination of IkappaBalpha[J].Mol Cell Biol,2000，20(7):2326-2333.

[14] Saha A，Deshaies RJ.Multimodal activation of the ubiquitin ligase SCF by Nedd8 conjugation[J].Mol Cell,2008，32(10):21-31.

[15] Soucy TA,Smith PG,Milhollen MA,etal.An inhibitor of NEDD8-activating enzyme as a new approach to treat cancer[J].Nature,2009,458(7239):732-736.