溶酶体靶向的汉坦病毒包膜糖蛋白DNA疫苗的体液免疫评价和攻毒保护效果①

张锦鹏 张冠文 宣国云 张 欢 姜东伯 杨 琨

(第四军医大学基础部免疫学教研室，西安 710032)

汉坦病毒(Hantavirus，HTV)属于布尼亚病毒科布尼亚病毒属的一类有包膜分节段单股负性RNA病毒[1]。主要通过接触啮齿类动物的呼吸道分泌物传播，导致两种自然疫源性疾病：分别为肾综合征出血热(Hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)和汉坦病毒肺综合征(Hantavirus cardiopulm-onary syndrome,HCPS)[2]。HFRS是以发热、出血、急性肾功能损伤为主要临床表现的综合征，亦称流行性出血热[3]。我国是世界上HFRS发病最为严重的国家，占总发病人数的90%以上，严重威胁我国居民的生命健康与安全[4]。基因疫苗因能够模拟病原体自然感染激活体内免疫应答，在生产、储存、运输方面具有优势而成为疫苗研制领域中的热点。

汉滩病毒基因组分为大(L)、中(M)、小(S)三个片段，分别编码病毒的RNA聚合酶、包膜糖蛋白(Gn和Gc)和核衣壳蛋白(NP)[5]。其中M片段全长仅有一个开放阅读框编码包膜糖蛋白复合体，该前体蛋白在细胞内质网被切割加工成Gn与Gc两个糖蛋白。Gn与Gc构成病毒吸附蛋白，可识别结合细胞表面病毒受体，在病毒对机体细胞的侵袭与感染过程中发挥重要作用[6,7]。同时，Gn和Gc可诱导机体产生特异性免疫应答，刺激机体生成一定量保护性的中和抗体。中和抗体在清除体内病毒这一过程中有重要作用，提示汉坦病毒的Gn与Gc在建立机体对抗病毒感染发病的特异性免疫保护机制中发挥重要作用[8-10]，有望成为DNA疫苗研究的靶点。

溶酶体相关膜蛋白(Lysosome-associated membr-ane protein，LAMP)是位于溶酶体膜上的Ⅰ型穿膜蛋白，由N端溶酶体内腔部分、疏水穿膜部分及C末端短胞浆尾构成。LAMP分子合成后，其保守的短胞浆尾通过穿膜-胞浆区定向结合亚细胞结构——内吞体/溶酶体，主要发挥靶向转运至溶酶体的重要功能[11]。当目的基因插入到LAMP分子编码溶酶体内腔部分和胞浆尾的基因之间表达出嵌合蛋白，利用LAMP分子胞浆尾靶向至内体/溶酶体膜作用，可将LAMP融合蛋白中目的抗原直接携带进入主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex，MHC)Ⅱ类分子器室(MHC class Ⅱ compartment，MⅡC)，从而可实现DNA疫苗所表达蛋白从内源性抗原的MHCⅠ类加工途径向外源性抗原的MHCⅡ类加工提呈途径的转化[12]。

1 材料与方法

1.1材料 重组质粒为本实验室前期构建保存，LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司。DNA测序委托生工生物技术(上海)有限公司完成。去内毒素质粒大提试剂盒购自北京天根生物有限公司140只SPF级6周龄雌性BALB/c小鼠购自第四军医大学实验动物中心[许可证号:SCXK(军)2012-0007]。汉坦inactivated病毒为本实验室保存，HRP标记的羊抗鼠IgG抗体为本实验室研制。MicroReader酶标仪(美国Bio-Rad公司)

1.2方法

1.2.1重组载体的构建及鉴定 重组表达载体的构建及鉴定参考文献[13,14]。并且转染实验显示目的基因能够在真核细胞中稳定表达[13,14]。

1.2.2重组基因疫苗的免疫方案 140只6周龄SPF级雌性BALB/c小鼠分7组(pVAX组、pVAX-LAMP组、pVAX-Gn组、pVAX-LAMP/Gn组、pVAX-Gc组、pVAX-LAMP/Gc组和inactivated疫苗组)，每组20只。按50 μl/只(质粒浓度均为1 mg/ml，inactivated疫苗按照1∶5稀释)经尾根部皮下免疫，共免疫3次每次间隔3周(图1)(注：按照灭活疫苗的使用要求，只进行2次免疫)。初次免疫前需采集正常小鼠血清，以后每次免疫后2周尾静脉取血，分离免疫血清，低温下保存用于抗体检测。

1.2.3间接ELISA法检测特异性抗体 用inactivated的病毒包被96孔ELISA板，4℃过夜。次日洗板并加入系列稀释的小鼠免疫血清，100 μl/孔，37℃孵育1 h，PBST洗涤4次后加入HRP标记的羊抗鼠IgG，100 μl/孔，37℃孵育1 h后，PBST洗涤4次，TMB显色10～30 min，ELISA板置于酶标仪测定OD450 nm值。

1.2.4中和试验 将免疫鼠血清用MEM培养液1∶5稀释，以0.22 μm滤膜过滤除菌，然后作系列倍比稀释，分别与100倍TCID50的HTNV混合，37℃孵育90 min，依次加于单层Vero E6细胞中，每个稀释度血清设3个复孔。同时设立病毒对照组，细胞对照组和阳性mAb A3D8对照组。37℃、5%CO2继续孵育90 min后，吸弃培养液，换入含2%血清的MEM培养液，37℃、5%CO2继续培养，感染9～11 d后收集培养细胞并冻融3次，夹心ELISA法检测细胞中感染的病毒：mAb 1A8或SP2/0(1∶1 000)包被ELISA板，4℃过夜，洗涤3次后，加入细胞冻融液100 μl/孔，37℃孵育1 h，洗涤后加入HRP-1A8 mAb，37℃孵育1 h，洗涤后OPD显色10～30 min，2 mol/L H2SO4中止反应，测OD490nm值。

1.2.5攻毒实验 在第60天，各组小鼠注射76～118病毒株(105pfu/只)，3 d后处死小鼠，夹心ELISA和实时定量PCR(qRT-PCR)检测攻毒后体内各组织特异性抗原NP病毒载量(VL)评价体内保护效力。所有实验均在BSL-3条件下，并基于国际实验室的生物安全手册。

图1 小鼠免疫策略Fig.1 Strategy of mice immunizationNote:BALB/c mice were immuned every three weeks for three times.Blood was taken from caudal vein two weeks after every immunization.

图2 ELISA检测特异性抗体Fig.2 ELISA were used to dectect specific antibodyNote:The specific humoral responses elicited against Hantavirus Gc were measured by detecting specific antibody.Results showed that titer of specific antibodies in serum of each group got higher in the wake of immunization times. The pVAX-LAMP group had the highest antibodies efficacy reaching to 1∶2 500,followed by pVAX-Gc and pVAX-LAMP/Gn.Compared to pVAX and pVAX-L1AMP group,pVAX-Gn and Inactived vaccine group were negative in antibodies.

图3 中和抗体检测Fig.3 Neutralizing antibody detectionNote:pVAX-LAMP/Gc group had the highest neutralizing antibody efficacy.Chimeric DNA vaccine groups all significantly had higher efficacy than Inactived vaccine group.

图4 免疫后小鼠注射病毒通过ELISA和q-PCR检测重要脏器的病毒载量Fig.4 ELISA and q-PCR were used to detect viral load after virus challengingNote:To measure the protective efficacy,virus challenging in vivo and were conducted by viral load detection after prophylactic immunization.Except pVAX and pVAX-LAMP,other groups of mice were negative in Hantaan virus-specific antigen,which suggests chimeric DNA vaccine can protect mice viscera from Hantaan virus.

2 结果

2.1免疫血清中的特异性抗体 结果显示，随着免疫次数的增加，各组小鼠血清中特异性抗体滴度逐渐升高。pVAX-LAMP/Gc组的抗体效价最高，3次免疫后达到1∶2 500，其次是pVAX-Gc组和pVAX-LAMP/Gn组，均明显优于Inactived vaccine组，然而pVAX-Gn组与 Inactived vaccine组抗体效价未见明显差异。对照pVAX组和pVAX-LAMP组未有抗体检出(图2)。

2.2中和抗体 pVAX-LAMP/Gc组小鼠血清中和抗体效价最高，依次为pVAX-Gc组、pVAX-LAMP/Gn组和pVAX-Gn组，抗体效价均明显优于Inactived vaccine组(图3)。

2.3攻毒实验 除pVAX、pVAX-LAMP两组外，其余组小鼠体内未检出汉坦病毒特异性抗原，表明小鼠重要脏器可在重组疫苗的保护下免受病毒感染(图4)。

3 结论

目前我国临床上用于防治HFRS的疫苗的是双价inactivated疫苗[15]，可以产生具有保护活性的中和抗体，诱导机体产生较为有效的体液免疫。然而，该疫苗在诱导机体产生细胞免疫应答及产生长期免疫记忆能力方面存在不足，大大降低了它在公共卫生安全领域中的推广价值[16]。现传统DNA疫苗表达的内源性抗原，主要通过MHCⅠ类抗原加工提呈途径活化CD8+T细胞，因此很难有效活化CD4+T细胞[17]。但活化CD4+T细胞能够分泌大量细胞因子，在刺激其他免疫细胞活化、增殖、分化以及促进，调节免疫应答过程中，发挥着重要的作用。此外CD40L由活化的CD4+T细胞表达，是作为活化B细胞必不可少的第二信号，促进B细胞产生，分泌抗体，发挥机体的体液免疫[18]。

LAMP分子是溶酶体膜上的主要成分，当其由LAMP基因合成后，其保守的短胞浆尾通过穿膜-胞浆区定向地结合亚细胞结构——内吞体/溶酶体，发挥靶向转运至溶酶体的重要功能[11]。本实验利用LAMP这一特性，将编码目的抗原的基因插入到编码LAMP分子的序列中，利用LAMP分子，将HTNV包膜糖蛋白(Gn和Gc)直接携带进入MⅡC，实现一种新的转换MHC抗原加工提呈的途径，有效地激活了CD4+T细胞[12]。活化的CD4+T可以分泌大量细胞因子，刺激其他的免疫细胞的活化、增殖、分化[19]，又能表达CD40L，作为第二信号辅助B细胞活化从而分泌特异性抗体，有效提高了DNA疫苗的免疫效率[20]。

前期曾有文献报道以汉坦病毒M全长为目的基因研制基因疫苗，并发现其能诱导产生一定滴度的中和抗体。但M全长较长，与LAMP分子(1 200 bp)重组后会有目的蛋白过大表达量低的问题。并且根据病毒M基因在表达前体蛋白后会在WAASA序列处切割为Gn和Gc两个糖基化蛋白[21，22]。因此，本次研究分别以Gn和Gc为目的基因通过分子克隆手段，利用HTNV糖蛋白cDNA成功构建重组真核表达载体pVAX-LAMP/Gn、pVAX-LAMP/Gc。以上实验结果表明，一方面，本实验成功构建HTNV包膜糖蛋白(Gn和Gc)嵌合溶酶体相关膜蛋白LAMP的重组质粒载体，并且证明其可在真核细胞中正确表达。在免疫评价中，汉坦病毒包膜糖蛋白Gn和Gc均可诱导小鼠产生良好的免疫应答。说明Gn和Gc有很好的免疫原性，均可作为HFRS的DNA疫苗良好的靶点。LAMP组在诱导抗体上明显优于传统DNA疫苗，可见LAMP分子策略在基因疫苗研制方面独有的优越性，有着良好的临床应用前景[23]。该研究为后续新型汉坦病毒基因疫苗的研究奠定了坚实的基础。

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