黑龙江省洋葱主产区鳞茎致腐病原分离鉴定

王 勇，高璐瑶，张 郑，袁巧玲，陈 典

（1.东北农业大学园艺园林学院，哈尔滨 150030；2.农业部东北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，哈尔滨 150030）

洋葱（Allium cepa L.），别名球葱、玉葱、荷兰葱，为葱科葱属二年生植物，广泛应用于医药、保健和食品等领域[1]，近年来随洋葱种植面积及市场需求量递增，气候环境改变，洋葱病害凸显。软腐病、黄矮病、霜霉病、紫斑病等为洋葱常见病害，我国洋葱产区有甘肃、内蒙古、新疆、黑龙江、吉林、山东、河南、云南等地。在黄河及以南地区，洋葱栽培方式为秋播，病害发生相对较少，黑龙江省洋葱为春播栽培模式，产量形成时期恰为高温多雨季节，病害发生普遍，危害程度严重[2]，特别是生长后期，洋葱鳞茎常出现腐烂现象[3]。明确致病菌，筛选抗源材料，培育抗病品种，加强栽培管理措施、防治害虫、结合药剂综合防治，可有效降低病害发生。

此前，普遍认为洋葱软腐病病原菌为胡萝卜软腐欧氏杆状细菌胡萝卜致病型（胡萝卜软腐欧式杆菌）（Erwinia carotovora subsp carotovora(Jones)Bergey et al.）[4]，该病原侵染植株后，感病鳞茎中心鳞片先腐烂，外部不易发现，发病后球茎变软，后期大量菌液溢出[5]。但近年，黑龙江省洋葱鳞茎腐烂病害呈多样化，侵染点分别转移至叶鞘部、茎盘基部、鳞茎夹层部位，逐渐腐烂。目前尚无不同腐烂类型病原的系统分类研究。为此，在黑龙江省哈尔滨、齐齐哈尔和牡丹江三地采集洋葱病样，分离培养病原菌，结合形态鉴定和16SrDNA序列分析，鉴定病原菌，为洋葱抗源材料筛选和病害综合防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

洋葱腐烂鳞茎于2016年7月至8月在黑龙江省哈尔滨市东北农业大学园艺试验站、齐齐哈尔市梅里斯区、牡丹江宁安镇等地采集，取病健交界组织作病原分离鉴定，病样采集及处理等参照李焕玲试验方法[6]。

1.2 病原菌分离

将洋葱腐烂鳞茎用蒸馏水冲洗1～3 min，75%酒精擦洗表皮，表面消毒，无菌水反复冲洗3次。在无菌操作台中，用灭菌手术刀片将洋葱鳞茎对半剖开，染病鳞茎病健交界处切取1～3 cm小块组织，置于研钵中研磨，加入少量灭菌水稀释，静置使致病菌溶于无菌水中，采用平板划线法分离病原菌。用接种针蘸取洋葱病健交界处组织提取液，分别在NA和CVP培养基上划线，28℃恒温培养24 h，待菌落长出后分离纯化[7-9]。

将纯化后细菌调至3×108CFU·mL-1，接种于洋葱健康鳞片上，7d后观察发病情况。根据柯赫氏法则，从发病洋葱鳞茎上分离纯化病原菌，与原菌落形态、颜色等生理生化性状作比较，确定致病菌株。

挑取菌液置于15%灭菌甘油中，-20℃保存于灭菌离心管。

1.3 病原菌鉴定

1.3.1 形态学性状观察

采用划线法将各菌株在NA培养基上28℃恒温培养24 h，观察菌落质地、形状、尺寸、边缘、表面隆起形状、透明度、菌落及培养基颜色等培养性状[10]。

1.3.2 革兰氏染色

采用结晶紫草酸铵染色法染色后[11]，S-3 400N扫描电镜下，观察单细胞形态。

1.3.3 生理生化测定

试验菌株作生理生化测试[6]，主要包括吲哚产生、明胶液化、酷素水解、酷氨酸水解、柠檬酸盐及丙二酸盐利用等生理生化指标测定。

1.3.4 细菌16SrDNA序列分析

扩繁候选菌株，细菌基因组DNA提取方法采用CTAB法[12]。对分离致病细菌作聚合酶链式反应（PCR）扩增，PCR扩增引物根据16S rDNA两端恒定序列设计，上游引物为27F：5'-CCGGATCC AGAGTTTGATCATGGCTCAGCA-3'，下游引物为1492R：5'-CGGGATCCTACGGCTACCTTGTTACGA CTT-3'）。PCR扩增反应体系为：10×PCR Buffer，2μL；10 mmol·L-1dNTP，0.2μL；10 mmol·L-127F，1492R各1 μL； 10 ng·μL-1模板DNA，1 μL；Taq DNA聚合，0.2μL；ddH2O补足至20 μL。PCR扩增反应程序为94℃预变性5 min，94℃变性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30个循环，之后72℃延伸10 min，4℃保存，具体参考张艳菊等方法[13]，扩增产物送至华大基因测序后，于NCBI网站Blast搜索，通过DNAMAN 6.0比对序列间同源性[14]。

2 结果与分析

2.1 病害症状

洋葱发病鳞茎有3种腐烂表现（见图1）：一为病原菌从鳞茎叶鞘基部侵入，叶鞘向鳞茎内缩，内部鳞片先腐烂，由内而外逐渐发病，同时伴有腐烂臭味；二为鳞茎夹层鳞片感染病菌开始腐烂，之后向内部鳞茎浸染，浸染速度较慢；三为病原菌由鳞茎茎盘基部侵入，从鳞茎内部腐烂并向外皮延伸，发病初期外观不明显，后期手压软化，发病严重时有汁液流出。

2.2 洋葱鳞茎致腐病原分离

致腐病原菌分离采用平板划线法，将病健交界组织提取液分别划线培养于NA、CVP培养基上，挑取单菌落纯化培养。在NA培养基中分离12种菌株，分别编号W-1至W-12，其中W-1至W-4来自叶鞘基部腐烂病样，W-5至W-8来自夹层鳞片腐烂病样，W-9至W-12来自茎盘基部腐烂病样；在CVP培养上纯化培养获得菌株9种，分别编号为Z-1至Z-9。Z-1至Z-3菌株来自叶鞘基部腐烂病样，Z-4至Z-6菌株来自夹层鳞片腐烂鳞茎病样，Z-7至Z-9菌株来自茎盘基部鳞茎病样。

图1 洋葱鳞茎腐烂田间发病症状Fig.1 Soft rot of onion bulb in thefield

2.3 致病性测定

将分离得21种菌株，参考吕和平等方法[16]，以离体回接方式回接至洋葱鳞片，调查各菌株致病情况。在所分离获菌株中，18种菌株对洋葱无致病性，发病率为0；W-1、W-5、Z-7 3种菌株对洋葱具致病性，其中W-1发病率低，W-5、Z-7发病率相对较高，均在60%以上，因此判断W-5和Z-7为主要致病菌株。W-5来自鳞茎夹层鳞片腐烂病样，另一种主要致病菌株Z-7来自茎盘基部腐烂病样，2种菌株致腐症状与采集发病洋葱鳞片腐烂症状一致（见图2）。将接种后发病鳞茎再分离，病原菌与原接种菌一致，说明2种菌株均为洋葱鳞茎软腐病致病菌株。

2.4 病原菌鉴定

2.4.1 形态鉴定

2种菌株中的W-5在培养基中菌落呈圆形或近圆形，不透明，乳白色，稍隆起，边缘整齐，光滑发亮，28℃条件下在NA培养基上生长良好。致病菌株Z-7在培养基中菌落呈圆形或近圆形，不透明，乳白色略带紫色，稍隆起，边缘不规则，28℃条件下在CVP培养基上生长速度较慢。

表1 回接鉴定结果Table1 Resultsof theidentification

图2 回接鉴定Fig.2 Return connection identification

图3 不同培养基菌株生长状态及电镜观察Fig.3 Growing strain of different culturemedium and electron microscopeobservation

将致病菌置于电镜下超微观察。电镜下2种致病菌均呈杆状，但形状及鞭毛存在差异：菌株W-5菌体为杆状，长1.0～3.1μm，两端钝圆，边缘整齐，极端生长1～4根鞭毛；菌株Z-7菌体为杆状，长0.8～3.0μm，极端生长多根鞭毛（见图3）。

2.4.2 革兰氏染色及生理生化测定

将致病菌株作革兰氏阴阳性鉴定。2种菌均可在3%KOH溶液中拉出菌丝，表明W-5、Z-7均为革兰氏阴性细菌。

对试验菌株作生理生化测试，发现2种菌株在37°C生长状态良好，均可使明胶液化，具耐盐性及过氧化酶活性。在碳源利用上，2种菌株均可利用柠檬酸和丙二酸作为碳源，且可使蛋白胨中色氨酸分解。但W-5可使硝酸盐还原为亚硝酸盐，而Z-7不具备该能力。此外，二者均难以水解酪氨酸，说明其对植物遗传无分解作用，不是腐生细菌。结合2种菌株形态特征与生理生化特性，初步推测菌株W-5为假单胞菌属，菌株Z-7为伯克霍尔德菌属（见表2）。

表2 菌株W-5、Z-7生理生化特点Table2 Physiological and biochemical charactersof strain W-5 and Z-7

表3 W-5与GenBank中登录菌株r DNA序列同源性比较Table3 Sequencecomparison between W-5 and thoseloaded from GenBank

图4 细菌通用引物对病菌模板DNA扩增结果Fig.4 Resultsof PCR amplification with universal specific primersto genomic DNA

2.4.3 分子鉴定

为进一步确定致病菌种属关系，以2种疑似菌株基因组DNA为模板，利用细菌16SrDNA通用引物（27F，1492R）PCR扩增，2种菌均扩增目的条带，其大小与预期一致（见图4）。将胶回收后PCR产物送华大基因公司测序，测序结果显示，菌株W-5和Z-7扩增产物均为1 338 bp。比对分析所得序列与GenBank中核酸序列，Blast对比结果显示（见表3），W-5菌株与GenBank中登记号为LT629801.1、KT695839.1、KT695836.1、AB819473.1、KF054779.1和JX994152.1等菌株同源性较高，达99.9%以上，可确定该菌株为罗氏假单胞菌（Pseudomonas rhodesiae）；Z-7菌株与GenBank中登记号为CP019670.1、CP019668.1、CP017238.1、CP019669.1、CP000458.1和CP000378.1等菌株同源性达99.6%以上（见表4），确定该菌株为洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）。

表4 Z-7与GenBank中登录菌株r DNA序列同源性比较Table4 Sequencecomparison between Z-7 and thoseloaded from GenBank

3 讨论与结论

洋葱常见病害有紫斑病、霜霉病、疫病、软腐病等[3]，前几种病害发生于生长期间，主要为真菌性病害，而软腐病在生长后期至贮藏期均有发生。一些真菌如尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum Schlechtendahl emend.SnyderHansen）和层出镰刀菌（Fusarium proliferatum（Matsushina）Nirenberg）可造成洋葱鳞茎腐烂[16]，但该病大面积发生仍以细菌为主要致病菌。为此，本试验采用细菌培养基作分离鉴定。

目前已鉴定胡萝卜软腐欧文氏杆菌胡萝卜软腐亚种（Erwinia carotovora subsp.carotovora）和菊欧文氏杆菌（Erwinia chrysanthemi）及1种肠杆菌科细菌（Enterobacter sp.）均可导致魔芋腐烂[17]。欧文氏杆菌是马铃薯软腐病主要致病菌，但因地域不同发生亚种分化：Erwinia carotovora var.carotovora是全国范围内主要病原菌，Erwinia carotovora var.atroseptica主要发现于黑龙江、青海、河北、甘肃及四川等省，Erwinia chrysanthemi是四川、江苏、江西及内蒙古致病菌株之一[18]。

胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种（Pectobacyerium carotovorum subsp.carotovorum）原名胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种（Erwinia carotovora subsp.carotovora），是一种寄主广泛植物病原细菌，可造成多种作物软腐病。此前，胡萝卜软腐欧氏杆状细菌胡萝卜致病型（Erwinia carotovora subsp.carotovora）被公认为洋葱软腐病致病菌，其引发症状与本试验中第三种类型一致，吕和平、徐冬等在甘肃地区洋葱病样中分离出该种病原菌，说明其为造成洋葱鳞茎腐烂主要致病菌之一[15,19]。胡萝卜软腐欧氏杆状细菌以聚果胶酸钠为唯一碳源[20]，本研究中配制CVP培养基以避免遗漏该细菌，但并未分离出该病菌，仅在相同侵染症状病样中分离出洋葱伯克霍尔德菌，说明黑龙江省洋葱软腐病优势致病菌可能为洋葱伯克霍尔德菌。

除胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种外，其他细菌可造成洋葱鳞茎腐烂，如甘肃地区格氏沙雷氏菌（Serratia grimesii）。但此前尚无罗氏假单胞菌（Pseudomonas rhodesiae）相关致病报道。本试验首次明确罗氏假单胞菌（Pseudomonas rhodesiae）可引起洋葱鳞茎腐烂，但其侵染循环和发病规律有待进一步研究。本试验未从叶鞘基部开始腐烂病样中分离致病菌，可能与细菌对培养基适应度有关。此外，假单胞菌属和洋葱伯克霍尔菌在洋葱鳞茎腐烂是否存在互作关系尚不明确。

通过分离鉴定黑龙江省3个地区洋葱鳞茎病样本，经菌株分离纯化，回接鉴定确定W-5和Z-7为主要致病菌。为确定致病菌菌属地位，以传统形态学鉴定为基础，结合16SrDNA序列分析方法鉴定菌株，结果显示，菌株W-5为罗氏假单胞菌（Pseudomonas rhodesiae），侵染可造成洋葱鳞茎夹层鳞片腐烂，菌株Z-7为洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cenocepacia），与洋葱鳞茎茎盘基部起始腐烂相关，对指导洋葱抗病育种及病害综合防治具有参考作用。

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