胎儿染色体非整倍体无创检测在产前诊断中的应用价值

张丽科 余学高 黄彬 刘集鸿

自1997年Lo团队发现了孕妇外周血中存在胎儿游离DNA（cell⁃free fetal DNA，cffDNA）以来，基于cffDNA进行胎儿疾病的研究迅速成为热点［1］。产前诊断也逐渐由介入性产前诊断向无创性产前检测（non⁃invasive prenatal testing，NIPT）进展。随着以高通量、自动化为显著特征的下一代测序（next⁃generation sequencing，NGS）技术的诞生，胎儿染色体非整倍体无创检测技术已面向临床［2］。但大部分的医疗机构都是收集标本后送往具有资质的第三方基因检测机构进行检测，仅有很少一部分医疗机构运用测序平台自主检测，对于NIPT在实验室检测过程中可能存在的问题报道较少。本文对中山大学附属第一医院自主检测的1 207例标本进行回顾性分析，总结NIPT检测的指征构成比及分析性能，分析NIPT在实验室检测过程中存在的问题，进而探讨NIPT在胎儿非整倍体异常诊断中的临床应用价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2016年1月至12月在中山大学附属第一医院接受NIPT检查的孕妇1 207例。孕妇年龄17～51岁，平均年龄（36.70±4.59）岁；孕周9～34周，平均20.5周。NIPT指征：血清学筛查高风险、超声提示胎儿结构异常、超声软指标异常、染色体非整倍体生育史、无明确遗传学诊断的不良生育史家族史、高龄（预产年龄≥35岁）。另外，部分孕妇虽无上述指征，但要求行NIPT检测，则采用统一知情同意书，充分告知孕妇NIPT的临床适应征、检测范围、局限性及可能存在的风险［3⁃4］，由孕妇自愿选择并签署知情同意书。所有对象均行B超检查。

1.2 方法

1.2.1 标本采集及处理

①采用EDTA抗凝管收集孕妇外周血6 mL，8 h内依次以4℃2 890 r/min离心10 min，13 000 r/min离心10 min进行血浆分离，每管650 μL分装后80℃保存。②应用DNA提取试剂盒，磁珠分离法抽提样品DNA（QIAGEN，德国）。③所提取的血浆DNA应用 T4DNA聚合酶（T4 DNApolymer⁃ase）、T4多聚核苷酸激酶（T4 PNK）、克列诺酶（Klenow enzyme）进行末端补平。在3′末端加碱基“A”，在DNA片段末端加上特定接头，通过PCR技术扩增两端带有接头的DNA片段，最终获得对应样本的DNA文库。将所得样本DNA文库进行质量检测，最后上机测序。

1.2.2 高通量基因测序产前筛查检测

采用Illumina Nextseq500二代测序仪进行测序。获得不低于400 M的有效reads数，平均每个样本不低于4 M的reads。运行序列比对软件BWA map将测序所得序列与人类基因组参考序列图谱比对。使用广州万德基因医学科技有限公司NIPT分析系统针对比对结果进行每条染色体序列个数统计。采用生物信息学对数据进行分析，计算Z值，利用Z值来评估胎儿患病风险（cut off：|Z|=3）。Z＞3代表该染色体可能是三倍体，Z＜⁃3代表该染色体可能是单倍体或者存在缺失。对NIPT高风险孕妇建议行介入性产前诊断及胎儿染色体核型分析。

1.2.3 结果验证及随访

对检测结果为高风险的孕妇，建议行介入性穿刺及胎儿染色体核型分析。对检测结果为低风险的孕妇进行生育前后随访。

1.2.4 统计学分析

统计学处理采用SPSS 22.0进行统计分析。符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（x±s）表示；计数资料采用描述性分析，用频数和频率表示，组间比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 1 207例NIPT检测的孕妇信息分析结果

1 207例选择NIPT的孕妇，包括双胎妊娠35例，单胎妊娠1 172例；高龄妊娠755例（62.55%），低龄妊娠452例（37.45%）；不良孕产史208例（17.23%）；孕妇无指征但要求检测165例（13.67%）。443例有行血清学筛查试验（36.70%），其中21⁃三体综合征（21⁃trisomy syndrome ，T21）临界风险与高风险共 291 例，18⁃三体综合征（18⁃tri⁃somy syndrome，T18）临界风险与高风险共21例，异常率为25.85%。B超检查结果显示：正常1 183例，异常24例，异常率为1.99%，主要表现为颈部透明带（nuchal translucency，NT）或颈部褶皱（nuchal fold，NF）增厚、鼻骨不清、双肾盂分离、单脐动脉、心脏室间隔膜缺失、脐膨出、羊水偏少、胎儿生长受限、胎率低、胎儿偏小等，数据见表1。

2.2 NIPT检测结果

1 207例临床标本中经基因测序检出高风险样本共20例，异常率为1.66%（20/1 207），其中T21高风险 8例（0.66%，8/1 207），T18高风险 7例（0.58%，7/1 207），21⁃单体或缺失高风险 3例，18⁃单体或缺失高风险1例和13⁃单体或缺失高风险1例。20例高风险病例经染色体核型分析确诊异常的有12例，其中高龄孕妇10例，占83.33%，见表2。

2.2.1 T21检测结果

8例高风险病例行羊水穿刺染色体核型分析，结果显示7例为T21核型，1例为正常核型，结果见表3。

NIPT检测T21的灵敏度为100%（7/7）、特异度为 99.92%（1 199/1 200）、漏诊率为 0（0/7）、误诊率为0.08%（1/1 200）、诊断准确度为99.92%（1 206/1 207）、阳性预测值为87.5%（7/8）、阴性预测值为100%（1 199/1 199）。

表1 1 207例入选NIPT的孕妇信息Table 1 Basic characteristics of the 1 207 pregnant women of NIPT

表2 20例NIPT阳性病历资料Table 2 Details of the 20 NIPT positive cases

8例T21高风险的样本Z值范围为4.029～9.858，平均 Z 值为 6.710±2.122，95%置信区间（95%confidence interval，95%CI）为 4.936～8.484。

表3 T21的NIPT与染色体核型分析结果比较Table 3 Comparison results of NIPT for T21 and karyotype analysis

2.2.2 T18检测结果

7例高风险病例经羊水穿刺染色体核型分析确证T18核型5例，正常核型2例，结果见表4。

NIPT检测T18的灵敏度为100%（5/5）、特异度为 99.83%（1 200/1 202）、漏诊率为 0（0/5）、误诊率为0.17%（2/1 202）、诊断准确度为99.83%（1 205/1 207）、阳性预测值为71.43%（5/7）、阴性预测值为100%（1 200/1 200）。

表4 T18的NIPT与染色体核型分析结果比较Table 4 Comparison results of NIPT for T18 and karyotype analysis

7例T18高风险的样本Z值范围为3.437～9.368，平均 Z 值为 6.593±2.352，95%CI为 4.418～8.768。

2.2.3 单体或缺失疾病检测结果

5例染色体单体或缺失病例经染色体核型分析均为正常核型。

2.2.4 临界风险结果

使用高通量基因测序技术对1 207例临床标本进行NIPT检测，有30例标本|Z|值处于临界风险，结果见表5。30例标本经复查，结果全为低风险。

30例临界风险标本初查|Z|值范围为3.014～4.407，平均|Z|值为 3.360±0.378；复查|Z|值范围为0.069～2.997，平均|Z|值为 1.404±0.803；两组数据进行配对t检验，t=12.052，P＜0.05，可认为两组结果差异有统计学意义。

表5 30例临界阳性标本复查结果Table 5 Review results of 30 critical positive specimens

3 讨论

NIPT是近年来兴起的一种新型检测手段，主要针对21、18和13号染色体进行检测。关于NIPT对胎儿染色体非整倍体异常的诊断效能评价，Yao、Norton 和张玢等［5⁃7］报道 NIPT 对 T21的阳性预测值可达90%以上，Wang等［8］报道NIPT对T18的阳性预测值为64%。Zhang等［9］的研究认为NIPT对T21、T18和T13的检测灵敏度分别为99.17%、98.24%和100%，特异度分别为99.95%、99.95%和99.96%。Qiang等［10］的研究显示NIPT对T21和T18的检测灵敏度分别为100%和100%，特异度分别为100%和99.86%。本文研究结果与Qiang等的研究结果类似。胎儿T13的发病率低，约为 1∶25 000［11］，本文研究标本数量有限，因此关于T13筛查的临床应用数据有待进一步积累。

美国医学遗传学与基因组学学会（the Ameri⁃can College of Medical Genetics and Genomics，AC⁃MG）指南建议，对于不同年龄阶段非肥胖的孕妇，在孕9～10周后可选择无创产前筛查（non⁃invasive prenatal screening，NIPS）来替代传统的血清学筛查进行 T21、T18和 T13的筛查［12］。在我国，现阶段NIPT的检测成本较为昂贵，且具有资质的检测机构有限，所以暂未被列为常规产前筛查项目，无法在适用人群中大面积普及和推广，因此临床产前筛查策略倾向于序贯检查。随着生活水平的提高和优生优育意识的加强，孕妇依据其个人目标与意愿选择诊断性或者筛查性技术的比例日益增大。一些血清学筛查低风险的孕妇因担心漏诊而进一步选择NIPT，也有部分经济条件较好的孕妇放弃血清学筛查直接行 NIPT［13］。

虽然NIPT被认为是一种精准的产前筛查，但不可否认NIPT存在检测假阳性和假阴性的问题，尽管发生概率极低，所以不能称之为诊断，更不能取代有创的羊水或胎盘绒毛膜穿刺［14］。段红蕾等［13］的研究显示，NIPT报告高风险者中，部分胎儿染色体核型分析未见异常，即NIPT存在部分假阳性结果。本研究20例高风险孕妇中有8例胎儿染色体核型分析正常，也说明了存在假阳性问题。引起假阳性的主要原因有母体基因组中拷贝数变异、限制性胎盘嵌合、母体染色体嵌合、双胎中一胎停育、母体存在恶性肿瘤［15］。因此，临床中须强调NIPT高风险不能作为引产指征，必须通过染色体核型分析确诊。

在20例NIPT高风险病例中，经染色体核型分析确诊异常的有12例，其中高龄孕妇10例，占83.33%，表明高龄是发生胎儿非整倍体疾病的一个重要危险因素。

有研究认为超声显示胎儿结构异常者，染色体异常发生率为10.1%，但其中T21、T18和T13合计仅占染色体异常的64.4%，其余约1/3的染色体异常不在NIPT的检测范围内［16］。本文24例B超显示胎儿结构异常者的NIPT结果均为低风险；12例确诊胎儿染色体整倍体畸形者的B超结果均为正常。提示B超结果与NIPT结果不相平行，两种筛查方法不可相互替代。B超对于胎儿非整倍体疾病的检出能力有限，对于结果正常者也应根据孕妇的其他危险因素酌情选择NIPT。而NIPT低风险人群并不能完全排除异常妊娠［17⁃18］，而仍需利用B超及时发现先天性心脏病、畸形儿等异常。

本研究中有30例标本初查结果为临界风险，经相同方法复查，均为低风险。两次的结果存在明显差异，原因可能为测序和数据分析存在随机误差。30例对象经随访自述结果均无异常。这提示NIPT在诊断临界值处的结果重现性欠佳。实验室对于临界风险结果的分析和判断应谨慎。研究发现当胎儿发生非整倍体疾病时，平均Z值会超过诊断阈值的2倍以上，若以95%CI判断，可提高诊断的准确度。另外，本研究从1 207例临床标本中检出21、18和13单体或缺失高风险5例。5例经染色体核型分析均为正常核型。提示NIPT在21、18和13单体或缺失疾病中的应用有待进一步研究。

综上所述，与传统筛查方法相比，NIPT具有灵敏度高、特异性佳、漏诊率低的优势，同时检测通量高、周期短，安全无创，可避免穿刺取样术带来的胎儿丢失、宫内感染等风险，是一种更加精确的胎儿染色体非整倍体产前筛查技术，是对现有出生缺陷三级预防体系的有效补充和完善。随着高通量测序技术的不断发展与更新，NIPT在临床的应用将会更加广泛。

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