微生物教学中噬菌蛭弧菌的最佳保藏方法探究

于 颖，牟星禹，陆 萌，罗 瑶，刘诗尧，杨玉婷，汪 红，樊 佳

(四川大学 生命科学学院，四川 成都 610065)

20世纪60年代，Stolp和Petiold首次分离得到了蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus)[1]。它广泛分布于自然水域、污水和土壤中，是一类专门以捕食细菌为生的寄生性细菌，可以有效裂解水体中的一些病原菌[2-3]，同时还可以缓解水体中一些有害物质的影响[4]，并且对鱼类致病菌有明显的裂解作用[5-7]，因此可利用该特性来防止水产动物的病害，其微生物生态制剂在水产养殖方面也发挥了较大的作用[8-9]。

噬菌蛭弧菌是一类可以寄生于其他细菌并使其裂解的革兰氏阴性细菌，因此，在半固体和固体介质中蛭弧菌侵噬宿主菌后会形成类似于病毒感染细胞后形成的空斑。利用这一特性，在教学中已成功开设了蛭弧菌菌斑观察实验[10]及蛭弧菌对污水净化实验[11]。通过上述实验，学生可以更加直观地了解到蛭弧菌特有的生物学特性。为了进一步探究蛭弧菌“活抗生素”的可行性，并使学生进一步了解蛭弧菌的特性，菌种保藏方法就显得极为重要。通常实验室采取4℃平板保藏法来保藏菌种[12]，该方法不但操作简单，且复活率达到100%，但是这种方法一般只能保藏4个月左右，4个月后培养基就会严重脱水变干，需要不断活化转种来保持它的生物学活性。因此该方法耗时繁琐不适合长期保存。为了方便实验教学，找到一种既可以延长蛭弧菌保藏时间又较为简便的方法尤为重要。而关于蛭弧菌的保藏方法，国内外的研究比较少，且各实验室报道结果各异。1963年文献[13]提出了在含有宿主细胞的YP琼脂中保藏蛭弧菌，每月转种一次的培养方法。2002年文献[12]为了探究蛭弧菌在水产养殖方面的作用，曾利用蛭弧菌Bd-9进行了5种保藏方法及其存活效果的观察实验，其结论为冷冻干燥法保藏效果最好，21个月的复活率高达100%，其次为4℃营养肉汤液保藏法和-20℃甘油保藏法，17个月复活率均为67%。2008年文献[14]发现以1/100 NB等低营养液体为保护液，琼脂为载体，加入适量宿主菌后保存于4℃，蛭弧菌保藏可达两年以上。而在国际上，公认的长时高效的保藏蛭弧菌菌株的方法有冷冻真空干燥法和液态氮超低温两种。这两种方法虽然有效，但其操作繁琐，成本高昂。其他一些简单易行的方法，如自来水宿主软琼脂保藏蛭弧菌培养物方法，虽然简单，但保藏时间较短且效果差[15]，不符合实验室教学时长期使用蛭弧菌的需求。因此为了寻找一种更为简单高效并适合实验室教学用的保藏方法，本文采用了-80℃甘油保藏法、4℃平板保藏法和4℃甘油保藏法这三种方法对实验室培养的蛭弧菌进行保藏处理，并筛选出最佳保藏方法为-80℃甘油保藏法。该方法的建立不仅简单快捷，而且降低了实验成本，同时也为继续开展蛭弧菌相关实验奠定了基础。

1 实验材料

1.1 试验菌种

本文蛭弧菌由四川大学微生物实验室提供；宿主菌为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，为本课题组保存菌种。

1.2 培养基及试剂

宿主菌培养基为液体LB培养基。蛭弧菌培养基为双层培养基，上层为0.4%琼脂LB半固体培养基，下层为2%琼脂培养基，具体配置方法见文献[11]。

1.3 主要仪器及试剂

GR85DA全自动灭菌锅购自Zeaway，1300系列-A2生物安全柜购自美国Thermo，SHP-080生化培养箱购自上海精宏，Micro-17离心机购自美国Thermo。甘油由市面上购买所得，121℃灭菌20 min；生理盐水(0.85%)121℃灭菌20 min。

2 实验方法

2.1 制备宿主菌菌悬液

勾取斜面培养基上的大肠杆菌菌体至液体LB培养基中，37℃震荡培养过夜，置于4℃冰箱中备用。

2.2 蛭弧菌纯液的制备

取已长有较大蛭弧菌单斑的双层平板，按无菌操作要求，用火焰灭菌的接种环挑取蛭弧菌单斑浸泡于装有1 mL灭菌生理盐水的EP管中，捣碎混匀后10 000 g离心10 min，用无菌注射器吸取上清液，再用0.22 μm的细菌过滤器去除大肠杆菌，以获得纯的蛭弧菌菌液。

2.3 蛭弧菌的保藏方法

2.3.1 4℃平板保藏法

将称装有3.5 mL已加热融化的上层半固体LB培养基冷却至约50℃，依次加入0.2 mL大肠杆菌菌悬液和0.3 mL蛭弧菌菌悬液，震荡混匀后立即倾倒于预制好的下层培养基上，待其凝固后置于28℃恒温培养箱中扩增培养24～120 h，观察培养皿中菌斑的生长情况。待长出较多的蛭弧菌菌斑后用封口膜密封好皿口，将培养皿倒置于4℃的冰箱中保藏。

2.3.2 4℃甘油保藏法

双层平板法培养蛭弧菌方法同2.3.1节。当观察到有大量蛭弧菌菌斑出现后，向其中加入10 mL已灭菌的甘油，并用封口膜将培养基密封好后置于4℃的冰箱中保藏。

2.3.3 -80℃甘油保藏法

蛭弧菌纯液的制备方法同2.2节。将菌液与甘油以4∶1的比例加入10 mL的灭菌管中，在振荡器上充分摇匀后，用封口膜密封管口。先将混合液置于-20℃的冰箱中预冷24 h，然后放入-80℃的冰箱中保藏。

2.4 蛭弧菌的复苏实验

取以上3种方法保藏的菌种定期进行复苏实验，观察保藏效果。蛭弧菌的复活方法为双层平板培养法。对4℃平板法保藏的蛭弧菌来说，先将双层平板的上层刮到灭菌的生理盐水中，并将培养基尽量捣碎，然后置于37℃下放置30 min，让更多的蛭弧菌游离出培养基。按2.2节方法，得到纯的蛭弧菌菌悬液。再按2.3.1节方法制成蛭弧菌双层平板，并分别在第1～第5天观察平板上菌斑的形成情况。对于4℃甘油平板保藏法所保藏的菌种，应先将培养基中的甘油倒掉后再制成菌液，再按上述方法进行试验。对于-80℃甘油保藏的菌液，待其恢复室温后便可直接使用，按上述方法制作双层平板以供观察。实验结果出现至少两个蛭弧菌菌斑为阳性，少于两个为阴性。

3 结果与分析

我们对三种不同方法保存的蛭弧菌定期进行复苏实验以检测菌种活性，并做统计。如图1所示，3种保藏方法复苏后的蛭弧菌均可形成噬菌斑。

(a)4℃平板保藏2个月 (b)4℃甘油保藏12个月板保藏方法时蛭弧菌可(c)-80℃甘油保藏18个月

图1 三种保藏方法比较

统计结果如表1所示。从表1中可以看到，采用4℃平板保藏方法时蛭弧菌可保存1～2个月；4℃甘油保藏法可保藏11～12个月；效果最好的是-80℃甘油保藏法，连续保藏18个月后，蛭弧菌仍保持较高的活性。

表1蛭弧菌不同保藏方法的活性鉴定结果

时间/月4℃平板保藏法4℃甘油保藏法-80℃甘油保藏法1+++2+++3-++4-++5++6++7++8++9++10++11++12-+

(续表)

时间/月4℃平板保藏法4℃甘油保藏法-80℃甘油保藏法13-+14+15+16+17+18+

注：+表示蛭弧菌检测结果为阳性；-表示蛭弧菌检测结果为阴性

4 结束语

蛭弧菌是一类可以通过细菌滤器并寄生于多种有害细菌并导致其裂解的革兰氏阴性细菌[16]，有望成为“活抗菌素”[17-18]，因此也被认为是自然净化的生物因子之一。基于蛭弧菌的这些独特的生物学特性，四川大学生物科学实验教学中心开设了一系列关于蛭弧菌的创新实验——用双层平板法培养蛭弧菌[10]、用平板菌落计数法验证蛭弧菌对污水的净化效果[11]和用相差显微镜观察蛭弧菌形态和运动[19]。上述创新实验均获得了较好的课堂效果和反馈，但在实际教学过程中由于蛭弧菌保存方法有限，蛭弧菌长时间保藏是一个难题。因此开发一种既能长期保存又成本低廉操作简单的菌种保存方法就成了当务之急。

本文使用同一种蛭弧菌及同一种宿主菌，对蛭弧菌的3种保藏方法进行了比较。结果发现-80℃甘油保藏法保藏时间可长达18个月，复苏后不仅第一代活性较高，而且第二代和第三代活性仍然较好。该方法不仅需要的仪器设备简单，操作步骤十分简便，而且不需要频繁接种。因此，该方法非常适合于基础实验教学中使用，为本实验教学中心继续开设蛭弧菌相关实验奠定了基础。

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