肺炎链球菌菌毛蛋白的结构功能研究

颜子乙 综述，崔亚利,2，张 静，郭思琪，颜灵逸，赵 雪，江咏梅,2△ 审校

(1.四川大学华西第二医院检验科，成都 610041；2.妇儿疾病与出生缺陷教育部重点实验室，成都 610041)

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae，S.pn)是上呼吸道常见的定植菌，菌体在突破机体免疫防御后，可引起肺炎、中耳炎、脑膜炎、败血症等局部或全身性感染，于5岁以下儿童和老年人群中有很高的发病率和病死率[1-2]。WHO将肺炎列为5岁以下儿童死亡的首要原因[3]，而儿童超过50%的重症肺炎由S.pn引起，并且在死亡病例中占有更高比例[4]。

菌毛作为S.pn重要的蛋白疫苗候选因子，可通过增强对宿主细胞的黏附、识别细胞外基质、参与生物膜形成等方式，介导细菌黏附于宿主细胞表面，也具有侵袭作用，可诱导机体产生炎性反应[5]，进而在宿主组织定植和致病过程中发挥重要作用[6-7]，同时，在S.pn感染的患者血清中，也可检测到抗菌毛蛋白抗体[8]。目前，已有学者对S.pn菌毛蛋白开展相关研究，并取得了阶段性成果，但相关报道较为零散，缺乏系统性。本文将围绕近年来S.pn菌毛蛋白的分型、结构特征和生物学功能的研究成果，并结合其作为蛋白抗原的免疫保护效果进行综述，旨在为后续研究提供更多思考方向。

1 S.pn菌毛蛋白的分型及结构特征

与其他革兰阳性细菌相似，S.pn菌毛为多个菌毛蛋白亚基共价装配形成的聚合体，每个菌毛蛋白亚基均含有分选酶(sortase，Srt)特异性LPXTG样基序，在特定的分选酶催化下，蛋白亚基间发生共价聚合，并将菌毛结构锚定在细胞壁表面的肽聚糖上[9]。

编码S.pn菌毛的基因以基因岛的形式存在，根据菌毛基因岛和蛋白亚基结构的不同，目前共发现两种类型的S.pn菌毛，Ⅰ型菌毛和Ⅱ型菌毛，前者由菌毛基因岛(pilus islet，PI)-1编码，是蛋白亚基RrgA、RrgB和RrgC形成的聚合体；后者由PI-2编码，是蛋白亚基PitB的聚合体。由于PI具有可移动遗传元件特征，S.pn菌株可同时表达两种菌毛、仅表达一种菌毛或不表达菌毛。

1.1 Ⅰ型菌毛结构特征

Ⅰ型菌毛是S.pn中发现最早的菌毛，也是表达最广的一类，流行率约为30%[10-11]。S.pn中编码Ⅰ型菌毛的PI-1共包括7个基因，分别是正向调节基因rlrA、表面结构蛋白亚基基因rrgA、rrgB、rrgC和分选酶基因srtC-1、srtC-2、srtC-3(曾被称为srtB,srtC,srtD)。其中，rrgA、rrgB、rrgC可编码LPXTG样基序(rrgA:YPRTG；rrgB:IPQTG；rrgC:VPDTG)，供分选酶识别催化亚基间的共价聚合，并将菌毛蛋白锚定到细胞壁表面[12]。

Ⅰ型菌毛遍布S.pn菌体表面，电镜下直径为2～6 nm[13]，长度可超过1.5 μm[14]，呈柔韧毛发样，直接与细胞壁表面肽聚糖连接。Ⅰ型菌毛主要由rrgA、rrgB和rrgC构成，其中RrgA和RrgC为辅助蛋白，RrgB是主要的骨架蛋白。RrgB共包含4个结构域，空间构型呈鼻样凸起，具有极性；蛋白亚基首尾连接组成蛋白原丝，2条蛋白原丝相互缠绕，构成S.pnⅠ型菌毛的主体结构[15]。由于PI-1的序列变异性，目前发现有3种亚型(RrgB cladeⅠ、RrgB cladeⅡ、RrgB cladeⅢ)，不同亚型的蛋白同源性为48%～60%，不同菌株的相同亚型之间蛋白同源性大于99%[16]，相同亚型间序列高度保守。

RrgA主要分布在Ⅰ型菌毛远侧端，成簇排列，为菌毛顶端蛋白，属于黏附分子，介导菌毛的黏附功能，可与胶原蛋白、纤维连接蛋白和层黏连蛋白等连接。与其他革兰阳性细菌相似，顶端蛋白RrgA不是S.pnⅠ型菌毛初始生成所必需的。RrgA蛋白包含4个结构域，包括1个整合素Ⅰ胶原识别结构域，这一区域由2条插入的“胳膊”折叠为1个带正电的摇篮结构，以及3个茎形成结构域组成[17]。由于PI-1中编码RrgA cladeⅠ与clade Ⅲ 同源性大于99%，RrgA仅分为两种亚型；且两种亚型间的变异主要集中在蛋白头部，细长的茎部仍然保守[18]。RrgC主要分布在S.pnⅠ型菌毛近菌体端，呈单个蛋白排列，包含3个结构域，由2个异肽键连接，结构呈弯曲杆状。在亚基的聚合过程中，RrgC不依赖PI-1编码的分选酶，而是由管家分选酶SrtA催化，将S.pnⅠ型菌毛锚定在菌体表面[19]。与RrgA和RrgB不同，S.pn菌株中RrgC蛋白亚基高度同源(>98%)。

1.2 Ⅱ型菌毛结构特征

编码S.pnⅡ型菌毛的PI-2共包括5个基因，分别是信号肽样蛋白基因sipA、结构蛋白基因pitA,pitB和分选酶基因srtG1、srtG2，整个基因岛位于蛋白酶T基因(PepT)和亚铁螯合酶基因(HemH)之间[20-21]。近年来，S.pnⅡ型菌毛流行率增加，约为20%，主要与血清1型,2型,7F型,19A型和19F型相关[22]。Ⅱ型菌毛主要由结构蛋白PitB的重复单元组成，其共价聚合由同源分选酶SrtG1和信号肽样蛋白基因SipA催化。PitB包含2个结构域，不同分子间的D1-D2结构域表达VTPTG基序，由SrtG1识别并首尾连接，而PitA和SrtG2并不是Ⅱ型菌毛形成所必须的[20]。作为新发现的S.pn菌毛类型，目前对S.pnⅡ型菌毛结构和功能的相关研究尚不深入。

2 S.pn菌毛的生物学功能

菌毛虽不是S.pn生存的必需结构，但作为介导菌体黏附宿主细胞的结构基础和毒力因子，在S.pn侵袭性感染的初始阶段发挥重要作用。

局部侵袭性感染是造成菌血症的基础，针对S.pn的呼吸系统感染，在S.pnⅠ型菌毛的黏附功能研究中，NELSON等[23]使用人肺泡上皮A549细胞作为宿主细胞，发现敲除rrgA的菌体，虽然形成菌毛结构，但黏附能力明显降低；敲除rrgB和rrgC的菌体，虽未形成菌毛结构，但黏附能力与野生菌毛型相似。这一发现表明S.pnⅠ型菌毛的黏附功能由RrgA介导，而非菌毛主链。后续NELSON等[23]在对S.pnⅠ型菌毛免疫机制的初步探究中发现，与无菌毛株相比，菌毛株不仅在定植、致病和引发败血症方面更具优势，还能有效诱发肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)的释放，提升宿主的炎性反应水平。在S.pnⅠ型菌毛蛋白亚基RrgA与宿主免疫损害机制的研究中，ORRSKOG等[24]分别使用敲除和未敲除rrgA的菌株，通过鼻内和腹腔攻毒实验，发现表达RrgA的菌株在野生型小鼠中，比使用补体受体3(CR3)抗体和CR3缺陷鼠更早出现败血症并有更快速的疾病进展，表明RrgA可通过与CR3的相互作用，影响巨噬细胞功能和全身感染状态，RrgA-CR3介导的吞噬作用可促进局部感染向全身性感染扩散。同时，BASSET等[25]的研究表明，RrgA可通过活化Toll样受体2(TLR2)，增强菌株的毒力和宿主的炎症反应。

S.pn引起的呼吸系统以外的感染，多由病原菌呼吸道侵袭后形成的菌血症发展而来。针对S.pn所致的脑膜感染，IOVINO等[26]通过静脉攻毒实验，发现菌毛株与无菌毛株相比，在脑中具有更高的菌体载量；当rrgA敲除后，菌毛株在脑中的载量下降。同时，表达RrgA的菌株更易分散形成单一球菌，对菌体通过血脑屏障起到促进作用。通过对黏附配体的进一步研究发现，RrgA可与血脑屏障上皮细胞表面的聚合免疫球蛋白受体(pIgR)和血小板内皮细胞黏附分子(PECAM-1)结合[27]，这两种受体的下调具有预防S.pn脑膜炎的潜力。

针对S.pn所致的中耳感染，FIGUEIRA等[28]通过鼻腔攻毒制造中耳感染模型，并分析中耳液。结果发现，虽然S.pnⅠ型菌毛并非S.pn感染中耳的必要因素，但菌毛株与无菌毛株相比，有着更高的菌体载量，提示S.pnⅠ型菌毛对中耳感染也具有促进作用。以上研究表明，S.pnⅠ型菌毛在细菌黏附、侵袭性感染与宿主免疫损伤，以及感染灶转移中均起到重要作用，RrgA蛋白亚基是其主要黏附因子和免疫介导因子。上述研究均表明，S.pnⅠ型菌毛的主要功能蛋白为RrgA,主要骨架蛋白为RrgB，S.pnⅠ型菌毛不仅具有黏附功能，还具有毒力作用，诱导宿主产生更严重的炎症损伤，在宿主局部性和全身性免疫应答中起重要作用。

与S.pnⅠ型菌毛不同，BAGNOLI等[20]通过对A549细胞的黏附实验发现，S.pnⅡ型菌毛通过PitB蛋白亚基和主链的结构构型，由骨架蛋白本身产生黏附效应，其黏附能力弱于RrgA。胶原蛋白、纤维连接蛋白和层黏连蛋白是S.pnⅠ型菌毛和S.pnⅡ型菌毛共同的黏附配体。综上所述，S.pn菌毛具有介导菌体黏附、组织定植、屏障侵袭，诱导机体炎症损伤等功能，在感染过程中发挥重要作用。

3 S.pn菌毛蛋白作为疫苗候选蛋白的潜力

目前，传统的S.pn多糖疫苗(pneumococcal polysaccharide vaccine,PPV)和结合疫苗(pneumococcal conjugate vaccine,PCV)已在部分国家和地区纳为计划免疫范围。但由于幼儿免疫系统发育未完全成熟，PPV所使用的多糖抗原不能在2岁以下儿童中产生有效的免疫保护[29]；PCV虽能引起有效的免疫应答，但覆盖血清型有限，且制造成本高，价格昂贵。有文献报道[30]，在计划免疫PCV7后，人群S.pn患病率未出现明显改变，而在S.pn流行株中非疫苗型菌株比例逐渐增加。此结果提示，在大规模使用血清型依赖疫苗后，S.pn流行株出现了血清型置换，降低了疫苗对人群的保护效果。

大量研究表明，多种S.pn毒力因子可作为新型蛋白疫苗的候选抗原，为S.pn感染提供广谱的保护效果，如胆碱结合蛋白(choline-binding protein,CBPs)、S.pn表面蛋白A和C(pneumococcal surface protein,PspA/PspC)、S.pn热休克蛋白(heat shock proteins,Hsp40/DnaJ)、S.pn表面黏附素(pneumococcal surface adhesin A,PsaA)及溶血素(pneumolysin,Ply)等[31-36]。然而，目前还没有商品化的蛋白疫苗能够100% 抵抗S.pn感染，继续寻找新的蛋白抗原位点不仅能有效促进蛋白疫苗的发展，还能通过免疫保护机制的研究，为药物作用靶点及保护效果更好的疫苗研发提供理论依据。

有研究表明，在传统S.pn疫苗免疫人群的初始阶段，由于疫苗型菌株的迅速减少，S.pnⅠ型菌毛在流行株中的表达短时间内急剧下降；但随后S.pnⅠ型菌毛的表达呈逐年上升态势，甚至超过传统疫苗普及前水平[37]，特别是在疫苗型菌株和耐药型菌株中，说明S.pn的PI具有可移动遗传元件特征，S.pnⅠ型菌毛对流行株的致病力和抵抗力有重要作用，可作为蛋白疫苗发展的候选抗原靶位进行深入研究。

现阶段S.pn菌毛蛋白疫苗的初步研究也主要针对S.pnⅠ型菌毛，其细小丝状的结构，可以很好地暴露在宿主免疫系统之下。GIANFALDONI等[38]使用重组S.pnⅠ型菌毛蛋白，评估免疫不同蛋白后，对避免小鼠发生S.pn菌血症的保护作用，发现RrgA、RrgB和RrgC均可刺激机体产生特异性抗体，其中RrgA和RrgB具有免疫保护作用，可明显延长受致死性S.pn剂量攻击小鼠的生存时间，而单一RrgC抗原蛋白免疫小鼠的保护作用欠佳。有研究发现，RrgA的两种亚型之间存在交叉免疫，RrgA clade Ⅱ型抗原免疫可保护小鼠免受RrgA clade Ⅰ型菌株的致死剂量攻击[18,39]，表明RrgA不仅具有免疫原性，还具有很好的保守性，是理想的菌毛疫苗候选蛋白。但RrgB的3种亚型之间无法形成交叉保护效果，针对RrgB的这一问题，研究人员使用S.pn TIGR4(RrgB cladeⅠ),S.pn 6BSPEC(RrgB cladeⅡ)和S.pn 35BSME15(RrgB cladeⅢ)的rrgB基因，构建出包含3种RrgB亚型的融合蛋白RrgB321，不同亚型的亚基之间使用Gly-Ser-Gly- Gly-Gly-Gly连接，使融合蛋白能够正常折叠。新构建的融合蛋白抗原RrgB321在主动免疫实验和被动免疫实验中，对避免小鼠产生S.pn菌血症具有较好的保护效果，其中在菌毛菌株中的抗血清介导的补体依赖性细菌吞噬作用水平与PCV7相当，表明RrgB321组分疫苗能成功形成针对S.pnⅠ型菌毛菌株的免疫保护作用，可覆盖总体S.pn菌株的30%以上。

目前，诺华公司研发的RrgB融合蛋白疫苗正处于临床前研究中[39]，通过鼻内黏膜免疫的途径，可在小鼠实验性S.pn中耳炎的病程初期降低中耳液中菌体载量。而菌毛蛋白疫苗由于抗原靶位的限制，仅针对菌毛株产生免疫保护作用，无法避免无菌毛株对宿主的侵袭性感染；在有菌毛蛋白抗体的环境中，菌体也可选择性不表达菌毛，逃避免疫攻击。为突破菌毛蛋白这一局限性，在进一步研究中，可与菌体保守蛋白联合制备多价疫苗，加强疫苗的免疫覆盖范围。例如，在S.pn胆碱结合蛋白A(PcpA)、S.pn组氨酸三聚体蛋白D(PhtD)、S.pn溶血素(dPly)组成的三联蛋白疫苗和由流感嗜血杆菌蛋白D、dPly、PhtD组成的三联蛋白疫苗已进入临床Ⅱ期试验的阶段[40]，可将菌毛蛋白与这些较为成熟的蛋白疫苗组分进行配伍，发挥菌体蛋白保守性高和菌毛蛋白易被免疫系统识别的双重优势。同时，不同的免疫剂量、免疫途径和免疫佐剂也可极大地影响菌毛蛋白疫苗的免疫效果，调整联合疫苗不同抗原间蛋白配伍比例，尝试多种免疫途径，选用新型免疫佐剂，可使菌毛蛋白疫苗达到更好的保护效果[41]。

4 展 望

时至今日，人们对S.pn菌毛结构和生物学功能的研究已经逐渐深入，但对其作为蛋白疫苗的保护作用及发挥作用的机制还有待进一步研究。在PPV和PCV普及之后，面对S.pn出现的流行株变换、菌毛表达反弹等趋势，人们对S.pn疫苗将抱有更多期待。菌毛不仅在S.pn致病过程中起到重要作用，同时在生物学功能、免疫原性、胞外表达、诱导抗体生成等方面均符合疫苗候选蛋白的选择指标，在疫苗设计与研发中具有很大潜力。然而，对重组S.pn菌毛蛋白疫苗的保护效果评估，大多还处于单一组分、单一模型阶段，缺乏同其他黏附蛋白或互补蛋白的联合评价，以及多器官、与病毒共感染模型的构建。继续寻找新的蛋白抗原靶位，评估新的蛋白疫苗联合模式，仍将是S.pn蛋白疫苗的发展方向。