细胞自噬在乳腺癌内分泌治疗耐药中的作用

高银华，罗泊涛，陆元志

(1 广东医科大学，广东湛江524023；2 广东医科大学附属医院)

乳腺癌是我国女性高发恶性肿瘤之一，每年新发病例约27.89万例，且患者趋于年轻化[1]。临床上约70%乳腺癌患者为雌激素受体(ER)或孕激素受体(PR)阳性，内分泌治疗是这类患者重要的治疗手段。他莫西芬是目前应用最为广泛的内分泌治疗药物，但30%～40%患者治疗后出现耐药。细胞自噬是指细胞通过降解自身结构或物质使细胞存活的一种自我保护机制，主要作用是清除细胞内错误折叠蛋白或损伤细胞器，以维持细胞稳态[2]。细胞自噬主要有巨自噬、微自噬和分子伴侣介导自噬三种类型。巨自噬是目前研究最多的自噬形式，其过程包括自噬体形成、自噬溶酶体形成和溶酶体内容物降解等步骤。自噬体形成又涉及自噬诱导、延伸、包裹成熟等关键步骤，受丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶ULK1/2、BECN-1等多个自噬相关基因(ATG)的严密调控[2，3]。有研究发现，细胞自噬与乳腺癌内分泌治疗耐药密切相关[4～6]。本文结合文献就细胞自噬在乳腺癌内分泌治疗耐药中作用的研究进展作一综述。

1 细胞自噬在肿瘤发生、发展中的作用

以往研究证实，细胞自噬是防止正常细胞恶性转化的重要机制。事实上，约40%乳腺癌、50%前列腺癌、75%卵巢癌组织中发现17号染色体(17q21)杂合性丢失，而这一区域缺失正好是BECN-1基因所在位点[7]。正常乳腺上皮几乎均表达BECN-1蛋白，而乳腺癌组织BECN-1蛋白表达明显降低；乳腺癌细胞MCF-7过表达BECN-1基因，细胞增殖明显受到抑制。在已发现的多种肿瘤组织中常出现EGFR突变或扩增，一方面可使其下游PI3K/AKT/mTOR信号通路过度激活，另一方面通过磷酸化BECN-1蛋白抑制自噬反应，促进肿瘤生长；且许多肿瘤伴有PIK3CA突变或抑癌基因PTEN失活，mTOR活性增强，进而抑制自噬功能[8，9]。有研究发现，PARK2基因敲除小鼠亦出现与BECN-1缺失类似表型，PARK2蛋白介导线粒体外膜蛋白泛素化，其缺失可导致自噬反应缺陷，损伤的线粒体无法被清除，超氧化物歧化酶增加，从而促进肿瘤发生[10]。

新近研究表明，细胞自噬还是维持肿瘤细胞存活和促进肿瘤细胞恶性演进的重要因素。在KRASG12D突变小鼠肺癌或胰腺癌模型中，同时敲除ATG5或ATG7基因能阻止肿瘤进展；在胰腺癌细胞中，关闭突变的KRASG12D功能，肿瘤细胞则进入休眠状态，并激活自噬反应[10]。提示细胞自噬能促进肿瘤进展。细胞自噬是缺氧状态下维持肿瘤细胞存活的主要途径。已发现在肿瘤组织缺氧区域中肿瘤细胞自噬体明显增多；而敲除ATG或药物抑制自噬反应则可促进细胞死亡[10]。肿瘤细胞还可通过上调自噬关键分子p62，使其与上皮间质转化(EMT)相关转录因子(如TWIST、SMAD4等)的结合更加稳定，继而促进EMT[11，12]。更重要的是，脱离原发灶的肿瘤细胞通激活内质网应激反应激酶PERK1及eIF-2α，选择性转录ATF4转录因子，促进ATG5、LC3蛋白表达，进而诱导细胞自噬，避免肿瘤细胞在循环中出现失巢凋亡[13]。PERK1还可通过NRF2途径激活LKB-AMPK信号通路，抑制mTOR信号，解除mTOR对细胞自噬的抑制作用[12]。在化疗、放疗或靶向治疗作用压力下，部分肿瘤细胞进入休眠状态，这些肿瘤细胞主要通过激活自噬反应而维持存活，并获得肿瘤干细胞的功能与表型[12]；而休眠的肿瘤细胞对细胞毒性化疗药物或靶向药物可产生耐受。上述研究证实，细胞自噬通过影响肿瘤细胞状态而改变肿瘤治疗反应[12，14]。目前，与自噬相关的关键分子(如p62)是否直接调控EMT及细胞休眠尚不完全清楚，在不同肿瘤中自噬调控肿瘤细胞生物学行为的确切分子开关需进一步研究。

2 细胞自噬在乳腺癌内分泌治疗耐药中的作用

2.1 细胞自噬与内质网应激 近年研究表明，抗雌激素治疗能诱导乳腺癌细胞出现未折叠蛋白反应，且相对于内分泌治疗敏感细胞，耐药乳腺癌细胞出现未折叠蛋白反应更早；基因敲减ERα后能抑制未折叠蛋白反应，并诱导细胞自噬[15]。提示ER信号通路可能不直接调控未折叠蛋白反应。硼替佐米和弗维司群共同作用于乳腺癌细胞后，可使细胞内ERα蛋白聚集，从而诱导未折叠蛋白反应并介导细胞死亡[16]。提示ERα信号通路及抗内分泌治疗均参与调控未折叠蛋白反应和细胞自噬，而且未折叠蛋白反应程度与持续时间是决定接受内分泌治疗乳腺癌细胞状态的关键因素。

未折叠蛋白反应是内质网应激的结果。营养缺乏、缺氧、氧化应激、化疗药物等均可干扰内质网稳态，使蛋白合成、折叠、修饰与分泌过程发生障碍，从而引发内质网应激，诱导未折叠蛋白反应。未折叠蛋白反应是一个高度保守的细胞应激反应过程，主要受核心调节因子葡萄糖调节蛋白78(GRP78)调控。生理条件下，GRP78定位于内质网膜上，并参与调控未折叠蛋白反应关键蛋白PERK、ATF6与IRE1结合，抑制调控分子的活性。内质网应激可使GRP78与以上三个关键蛋白分离，激活下游PERK-eIF2a-ATF4-CHOP、ATF6a-Sp1/Sp2-GRP78、IRE1a-XBP1信号通路，不仅能降低蛋白合成，还可诱导分子伴侣合成和激活蛋白降解途径，减少错误折叠蛋白生成，从而保护细胞，使其在应激条件下存活或启动凋亡。在乳腺癌中，PERK-eIF2a-ATF4活化一方面通过增加ATG12表达启动细胞自噬，另一方面通过加强LC3剪接促进细胞自噬。而未折叠蛋白反应的核心分子IRE能通过激活MAPK-JNK通路诱导细胞自噬[17]。此外，在内分泌治疗敏感乳腺癌细胞中过表达GRP78可诱导细胞自噬，而抑制AMPK活性则可降低自噬反应，但并未伴BECN-1蛋白表达变化。提示在抗内分泌治疗过程中，GRP78是未折叠蛋白反应与自噬信号整合的纽带，但并不一定通过经典的自噬通路调控细胞自噬[17，18]。而在内分泌治疗抵抗乳腺癌细胞中，阻断雌激素或抗雌激素治疗会改变葡萄糖和谷氨酰胺摄取并可影响未折叠蛋白反应激活[19]。

2.2 细胞自噬与细胞凋亡 凋亡抵抗是治疗抵抗包括内分泌治疗耐药的重要原因。肿瘤细胞凋亡抵抗主要与Bcl-2蛋白家族异常表达导致细胞线粒体凋亡信号通路失调有关。Bcl-2家族是含有Bcl-2同源区的一组蛋白，包括促进凋亡分子(如Bad、Bid、Bax等)、抑制凋亡分子(如Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1等)。有研究发现，细胞自噬的起始分子BECN-1蛋白具有与Bcl-2相似的BH3结构域，能与Bcl-2相互作用，以保持细胞凋亡与细胞自噬平衡。生理条件下，Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1等与BECN-1结合，抑制自噬起始复合体Vps34和PIK3C3活化，从而抑制细胞自噬；相反，Bad、Bid、Bax等与BECN-1结合，使Bcl-2与BECN-1分离，促进细胞自噬。提示Bcl-2表达水平是细胞凋亡与细胞自噬平衡的关键分子。研究发现，约85%ER阳性的乳腺癌组织Bcl-2蛋白过表达，Bcl-2蛋白过表达是早期乳腺癌(如原位癌)预后良好的独立影响因素，同时他莫西芬联合Bcl-2抑制剂可明显抑制ER阳性乳腺癌组织生长，诱导细胞凋亡和自噬依赖性死亡[20～22]。但在晚期内分泌治疗耐药乳腺癌中，Bcl-2蛋白表达明显降低，这可能是耐药乳腺癌细胞自噬增加的原因之一[5]。在葡萄糖缺乏或缺氧时，凋亡抑制因子Mcl-1迅速降解，细胞自噬被激活，且Mcl-1过表达可导致LC3Ⅱ分子在自噬体膜上呈点状分布，继而启动细胞自噬[23]。提示Mcl-1可调控细胞自噬并在乳腺癌内分泌治疗耐药中具有重要作用。研究发现，RNAi敲除Bcl-2基因可导致乳腺癌细胞MCF-7自噬增加和细胞死亡，而BH3模拟物可诱导乳腺癌细胞BECN-1依赖性和非依赖性自噬，从而避免细胞凋亡[24]。由此可见，靶向Bcl-2蛋白家族有可能为逆转乳腺癌内分泌治疗耐药提供新的策略。但Bcl-2蛋白家族成员之间及其与自噬调控分子之间的作用机制复杂，细胞凋亡与细胞自噬在乳腺癌内分泌治疗耐药中的作用仍需深入研究。

2.3 细胞自噬与乳腺癌间质成纤维细胞活化 乳腺癌是纤维间质反应最明显的恶性肿瘤之一。肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)是乳腺癌间质的主要成分，CAFs活化及其与肿瘤细胞共进化过程可参与调控肿瘤细胞的多种生物学行为，包括肿瘤细胞干性与耐药等[6，12]。研究证实，肿瘤细胞可通过释放多种炎症因子(如活性氧),诱导成纤维细胞衰老，改变间质成纤维细胞代谢状态，继而促进细胞自噬，同时通过自噬降解成纤维细胞表面小凹蛋白(Cav-1)、上调单羧酸转运蛋白4(MCT4)，促进RAS信号通路活化并获得活化表型。活化的成纤维细胞通过释放乳酸、酮体或自由脂肪酸等促进肿瘤细胞生长和内分泌治疗耐药[6，25]。成纤维细胞活化不仅可促进乳腺导管原位癌向侵袭性导管癌过渡，还是晚期肿瘤患者恶病质的重要原因[6，12，25]。此外，乳腺癌相关成纤维细胞敲除Cav-1基因后，乳腺癌生长迅速，且不依赖于雌激素或孕激素受体信号，但对mTOR信号通路抑制剂雷帕霉素治疗更为敏感[12，26]。乳腺癌成纤维细胞HIF-1α过表达可促进细胞自噬，增加细胞无氧代谢过程，降低线粒体氧化功能，最终促进乳腺癌细胞增殖；相反，在乳腺癌上皮细胞中HIF-1α过表达也能促进细胞自噬，但却抑制肿瘤细胞增殖，提示HIF-1α在乳腺癌间质中具有促癌功能，而在肿瘤细胞中却发挥抑癌作用[27]。在前列腺癌和乳腺癌间质成纤维细胞中自噬调控相关分子p62表达缺失，可通过mTORC1/c-Myc信号通路对成纤维细胞进行代谢重编程，同时诱发间质炎症反应并促进肿瘤生长[28]。此外，乳腺癌细胞中c-Myc过表达可促进miR-105合成，miR-105随着肿瘤细胞外泌体释放进入间质成纤维细胞，可靶向c-Myc抑制分子MXI1，继而激活c-Myc，增强成纤维细胞的糖酵解与氨基酸代谢，促进肿瘤生长[29]；而在成纤维细胞中Mct4基因表达受Myc调控[6]，这表明在乳腺癌间质成纤维细胞代谢重编程、细胞自噬及内分泌治疗耐药调控中，c-Myc与HIF-1α具有同等重要的作用。目前认为，绝大多数实体瘤组织处于缺氧状态，加上药物治疗等因素，通过HIF-1α调控间质成纤维细胞代谢重编程是赋予肿瘤细胞干性与耐药表型的重要策略，但不同因素可能通过不同机制活化成纤维细胞。传统中等剂量化疗药物可使乳腺癌间质成纤维细胞中STAT-1和NF-κB持续激活，继而活化成纤维细胞，促进ELR+类趋化因子释放。这些趋化因子与肿瘤细胞表面CXCR2受体结合，从而维持肿瘤细胞的干性并促进其耐药；但低剂量序贯性给药可抑制间质成纤维细胞激活和肿瘤细胞干性[30]。可见，HIF-1α及炎症相关信号通路(如NF-κB、JNK、STAT-1等)激活是缺氧等因素下调控成纤维细胞代谢重编程与活化的关键通路，这为肿瘤细胞存活与耐药提供了重要的微环境[17]。因此，阐明肿瘤细胞与间质成纤维细胞共进化中细胞代谢重编程及自噬反应的分子机制，将有利于靶向乳腺癌微环境逆转内分泌治疗耐药。

综上所述，细胞自噬参与了乳腺癌内分泌治疗耐药，其机制涉及UPR、Bcl-2蛋白家族以及微环境代谢重编程等，但其具体分子机制尚未完全阐明，仍有许多问题亟待解决。