原儿茶酸、白杨素对非酒精性脂肪肝细胞模型的抗氧化作用*

陈益耀 陈 轶 何周桃 巫华志

海南省人民医院消化内科 (海南 海口， 570311)

氧化应激是非酒精性脂肪性肝病的病因中重要的“二次打击”因素。课题组在前期的研究中发现，益智仁乙酸乙酯提取物能够通过抗氧化应激而达到防治非酒精性脂肪肝的作用。鉴于益智仁乙酸乙酯部中含有丰富的原儿茶酸及白杨素，而原儿茶酸及白杨素有抗氧化活性，故在细胞水平观察原儿茶酸及白杨素对非酒精性脂肪肝细胞模型的保护作用。

1 材料和方法

1.1 材料 细胞株：人正常肝细胞株L02，受赠于湘雅二院中心实验室。仪器设备：生物安全柜(型号：Sterile 90)；二氧化碳恒温培养箱(型号：AR-3100G)；酶联检测仪(型号：DG5031)；倒置相差显微镜(型号：Mitutoyo MF)。 药物及试剂：胎牛血清(四季青)；1640培养基(Hyclone)；青霉素-链霉素溶液(Hyclone)；ALT试剂盒、AST试剂盒、TG试剂盒、MDA试剂盒、SOD试剂盒、GSH-Px试剂盒、4%多聚甲醛固定液均购买自南京建成科技有限公司。白杨素标准品(北京索莱宝生物科技有限公司)。

参照文献方法提取益智仁中的原儿茶酸：95%乙醇浸泡益智仁粉后提取，经用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，收集乙酸乙酯部。100～140目硅胶柱层析，同时进行细胞活性实验，将有活性组分溶解于甲醇，Sephadex LH-20凝胶层析，经甲醇洗脱得到原儿茶酸。

1.2 方法 L02细胞复苏、培养：将L02细胞冻存管置于预热的水浴箱，冻存液融化后，将细胞转移至无菌离心管，加入细胞培养基，吹打、混匀后离心5分钟。弃去上清液，加培养液轻吹、混匀后接种于培养瓶内，放入培养箱(37℃、5%CO2)进行培养。

细胞传代：弃去培养液，PBS液冲洗细胞2遍，弃去PBS液，加入0．25%胰蛋白酶消化。显微镜观察细胞胞体收缩、变圆时倒掉胰蛋白酶，加入含10%胎牛血清的1640培养液终止消化，反复吹打，按1：2传代。

非酒精性脂肪肝细胞模型的建立：6孔板中置入无菌盖玻片(多聚赖氨酸包被)，接种细胞，培养24h，移除培养液，加入含1μl/ml 20%脂肪乳的1640培养液培养24h后传代，再次加入相同的培养液培养24h，进行模型评价。

油红O染色：①吸掉培养液，每孔加入2ml PBS。②吸掉PBS，加入1ml 4%甲醛固定、孵育30～60分钟。③吸掉甲醛，灭菌水漂洗细胞。④加入1ml 60%异丙醇孵育5分钟。⑤吸掉异丙醇，加入1ml 油红O液孵育5分钟。⑥吸掉染色液，灭菌水漂洗至背景无色。⑦加入1 ml苏木素孵育1分钟。⑧吸掉苏木素，用灭菌水洗至背景无色。⑨将盖玻片反扣在滴加80%甘油的载玻片上，指甲油封片。⑩显微拍照，细胞核染成蓝紫色，脂滴染成红色。

细胞分组：模型诱导成功后，对照组和模型组分别加入含10%胎牛血清的1640培养液，原儿茶酸组加入含10%胎牛血清和1.0μmol/L原儿茶酸的1640培养液，白杨素组加入含10%胎牛血清和20.0μmol/L白杨素的1640培养液，培养24h。

指标检测：用油红O染色镜下观察细胞内变化。收集细胞上清液检测AST、ALT 的含量；收集细胞裂解液检测MDA、GSH-Px、TG含量及SOD的活性。

2 结果

2.1 油红O染色结果 对照组L02细胞内未见橘红色脂滴。模型组脂肪乳干预的L02细胞内见大量橘红色的脂滴，细胞形态及活力均好。原儿茶酸组及白杨素组脂滴较模型组减少(见插页彩图1)。

2.2 肝细胞功能检测结果 见表1。

表1 原儿茶酸、白杨素对L02细胞AST、ALT、TG、MDA、GSH-Px及SOD的影响

与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

3 讨论

原儿茶酸、白杨素均是天然的小分子化合物，广泛存在于地椒、景天三七、锁阳、赤芝子等天然药材的乙酸乙酯提取物中[1～4]。在南药益智仁中这两种天然化合物含量丰富[5～7]。益智仁中的原儿茶酸通过抗氧化对损伤的PC12细胞有明显的保护作用[8]。另一项研究提示原儿茶酸能够提高帕金森模型大鼠超氧物歧化酶(SOD)活性，降低TNF-α、IL-1β及MDA水平，提示良好的抗氧化应激活性[9]。关于白杨素的研究提示，其能够缓解胰岛素抵抗，抗氧化应激[10]；通过抗氧化应激，对糖尿病大鼠脑损伤有保护作用[11]；它还能够提高谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、SOD活性，保护急慢性缺血导致的大鼠脑组织损伤[12]。原儿茶酸及白杨素均可提取自益智仁，并有着很好的抗氧化作用。

氧化应激在非酒精性脂肪肝的发展中扮演着重要的角色。胰岛素抵抗和脂肪代谢失衡引起脂肪酸、甘油三酯在肝细胞中的沉积，出现单纯性脂肪肝；在此基础上氧化应激加重损伤，诱发非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化[13～16]。本实验用含有脂肪乳的培养液培养L02细胞，使肝细胞脂质代谢紊乱，油红O染色提示肝细胞内有大量脂肪滴堆积，细胞裂解液检查提示TG明显升高，提示出现肝细胞脂肪变。GSH-Px、SOD是细胞内ROS清除酶的还原底物，是重要的抗氧化剂，当GSH-Px、SOD等未能完全清除ROS时，便出现氧化应激。而丙二醛(MDA)能抑制抗氧化系统，MDA升高说明存在脂质过氧化。模型组GSH-PX及SOD下降、MDA上升提示L02细胞内出现氧化应激及脂质过氧化。而ALT、AST的升高提示肝细胞受损。可见，实验中成功建立非酒精性脂肪肝细胞模型。经原儿茶酸及白杨素干预后，肝细胞内脂肪滴减少，TG下降，ASL、ALT下降，提示两者对非酒精性脂肪肝细胞模型有着保护作用；而两者均能够提高GSH-PX及SOD活性，降低MDA的含量，提示其作用机制是抗氧化应激。