类风湿关节炎相关外泌体及其治疗作用的研究进展

李培霆，李龙

(贵州医科大学，贵阳550004)

类风湿关节炎(RA)是一种慢性进展性自身免疫性疾病，以炎性细胞在关节处浸润、滑膜增生、血管翳形成、关节软骨及骨持续破坏为特征。RA早期关节疼痛、肿胀、发僵等一系列问题，使患者活动困难，如果得不到及时治疗，就会发展到慢性炎症失控状态。外泌体是源于细胞内吞作用的细胞外囊泡(EVs)，内含丰富生物信息，其存在于许多甚至是全部真核生物的体液中[1]。外泌体类似于病毒颗粒，可将特定的内含物包裹后运输至靶细胞，进而调控后者的信号转导通路以及基因表达，从而引起特定的生理功能。外泌体的蛋白组成较复杂,包括源细胞非特异性和特异性两类蛋白分子。前者包括热休克蛋白、参与细胞内信号转导的蛋白、各种代谢酶、细胞溶质蛋白和四跨膜蛋白等；后者只存在于某种特殊的细胞，如树突状细胞(DC)等[2]。外泌体除含有蛋白，还含有小RNA，如微小RNA(miRNA)和长链非编码RNA(IncRNA)，参与基因的表达调控，故外泌体内部所含的生物学信息有望作为自身免疫性疾病诊断的理想标志物。研究报道，外泌体参与RA的发病过程，在抗原表达、炎症、血管生成、细胞信号传导等方面发挥重要作用[3]。外泌体预示着细胞的病变，远早于组织和器官病变，对疾病早期诊断有重要意义，且有望作为药物传递的工具或RA治疗的靶点。

1 RA相关外泌体

不同自身抗体的检测对RA诊断具有不同程度的敏感性和特异性，但由于受年龄、血脂、基础疾病等因素影响,需要更多的生物标记物来更有效、更方便地诊断RA。外泌体作为最小的EVs已被认为是微环境中的通讯途径。它们在细胞间传递蛋白质和miRNAs，并具有免疫调节特性，在不同的关节疾病中已经检测到相关的外泌体类型，提示外泌体可作为诊断或评估RA活动的潜在生物标志物。

1.1 与RA相关的外泌体蛋白 研究发现，RA患者的滑膜液和血清EVs含有与RA相关的特异蛋白，这些蛋白质一半以上以瓜氨酸形式存在，进一步提高了其作为诊断指标的特异性。在RA患者血清中，外泌体淀粉样蛋白A和淋巴管内皮透明质酸受体-1蛋白与C反应蛋白之间存在显著的正相关关系，提示RA患者外泌体淀粉样蛋白A和淋巴管内皮透明质酸受体-1蛋白与疾病活动有关[4]。外泌体携带有瓜氨酸蛋白(如纤维蛋白原和波形蛋白)，作为自身抗原可被RA患者的自身抗体识别后诱导滑液中免疫复合物形成，进而刺激关节中性粒细胞产生白三烯，从而加重炎症。除了瓜氨酸蛋白，还有一种由巨噬细胞通过外泌体分泌的核DNA结合蛋白，也可作为自身抗原呈递给B细胞，产生自身抗体，形成免疫复合物参与关节炎症的发生[5]。最近研究表明，RA患者滑液中CD3+和CD8+T细胞源性EVs、CD41 EVs比骨关节炎患者显著增高，且骨关节炎中CD41 EVs无法检测到[6]。

1.2 与RA相关的外泌体酶 除了前面提到的蛋白，研究还发现一些酶类如金属蛋白酶氨基肽酶N与RA的发病有关。它在RA患者的滑液中作为EVs表面可溶性分子，可通过基质金属蛋白酶(MMP)-1从纤维样滑膜细胞表面(FLSS)裂解，诱导FLSS的生长和迁移，进一步加重关节炎症[7]。D和B-葡糖醛酸酶存在于RA和骨性关节炎患者关节间隙的EVs中，其在EVs中的定位表明它可能参与了RA的发展[8]。EVs还具有不同的黏附分子，促进其与免疫细胞的相互作用，如整合素ανβ3和ανβ5[9]。Rab27蛋白是外泌体分泌过程中必不可少的。研究发现，敲除Rab27基因的Treg细胞失去分泌外泌体的功能后，无法预防部分自身免疫疾病发生，最终导致严重的系统性炎症疾病[10]。

1.3 与RA相关的外泌体核酸 对外泌体miRNA差异的新认识为更早、更准确地检测RA提供了一种新方法。目前研究最多的miRNA是miR155和miR146a。miR155在FLS中可以抑制肿瘤坏死因子-α、MMP-13的产生[11]。RA患者FLSS中，miR146a表达可被肿瘤坏死因子-α和IL-1β上调，进而抑制IL-6和IL-8分泌，此外miR124a、miR19a等均具有调节滑膜细胞增殖和炎性因子的释放作用[12]。Kim等[13]研究发现，miR-let7b包含在巨噬细胞或RA成纤维细胞的EVs中，可作为TLR7的内源性配体，两者结合后可诱导幼稚髓系细胞分化为M1型巨噬细胞，从而释放促炎症因子，进一步加重关节炎症。不仅如此，一些可以调节信号通路的外泌体RNA也被陆续揭示。Maeda等[14]通过基因芯片筛选出22个FLS-miRNA的外泌体被证明可以调节RA中的骨通路，例如，肿瘤坏死因子(TNF)可上调RA FLS分泌的外泌miR-211-3p过表达，抑制成骨细胞的分化、钙化。除了miRNA，近年发现一种反转录IncRNA(Hotair)在RA患者血清外泌体中高表达，可诱导活化的巨噬细胞迁移，导致MMP-2和MMP-13水平明显降低[15]。可见外泌体中富含的蛋白质以及核酸不仅参与了RA的发病，而且还是RA具有诊断价值的生物标志物。

2 外泌体在RA治疗中的作用

众所周知，抗RA的药物包括非甾体类抗炎药、皮质类固醇和抗风湿疾病药物，这些疗法都没能从根本上治疗RA。然而药物的不良作用一直是RA治疗的障碍，特别是新的生物制剂。在RA中，利用外泌体能再次诱导机体对自身抗原的耐受，可防止疾病的发生发展。

有文献报道，在RA中检测到由FLSS释放的EVS是一种膜型TNF-α的EVS。这些TNF表达阳性的外泌体使活化的T细胞具有抗凋亡的能力，进而引起炎症反应，这也是T细胞介导RA的发病机制之一。提示阻断TNF表达外泌体是治疗RA的一种方法。DC衍生外泌体是非常稳定而被誉为肿瘤免疫治疗的“疫苗”。用带有FasL基因的重组腺病毒转染DC能够抑制胶原诱导的关节炎炎症反应。此外，IL-10诱导的DC来源的外泌体具有较强的抗T细胞活性。当分离、纯化后注射到炎症部位，炎症可得到减轻，注射的对侧关节炎症反应也得到了改善。还有研究表明，高表达吲哚胺双氧酶的DC起源的外泌体能够在一定程度上缓解胶原诱导小鼠的关节炎症状，且免疫抑制作用比DC本身还要强，可能是外泌体可促进Treg细胞的激活与增殖。因此,DC来源的外泌体可能为治疗RA的一种新疗法。在实验性关节炎模型中，中性粒细胞衍生的EVs已被证明对RA的软骨合成有促进作用。体外和体内实验表明，中性粒细胞可分泌含有抗炎症蛋白A(AnxA1)的EVs。促进软骨细胞产生TGF-β1，关节间隙注射含AnxA1的EVs可使炎症性关节炎小鼠软骨破坏减少[6]。

最新研究[17]发现，脂质体是一种类似外泌体的小人工囊泡，它具有装载药物进入细胞的能力。利用这一特性，将APO2L与脂质体结合后注射入动物的膝关节腔内可大幅减少滑膜增生和炎症。Vanniasinghe等[18]成功地将糖皮质激素以人工囊泡的形式传递到滑膜，在胶原诱导关节炎模型中观察到炎症减轻。通过脂质体的输送，可很大程度上减少类固醇类药物不良作用。Lamichhane等[19]发现，骨髓间充质干细胞释放的EVs是近年发现的简化无细胞的组织再生疗法，药物等活性分子可以被填充于骨髓间充质干细胞且衍生EVs,比单用骨髓间充质干细胞疗效增强，为治疗自身免疫性疾病的一种潜在替代方法。

免疫复合物在组织中的沉积被认为是RA发病主要机制之一。补体参与免疫复合物组成，且分布于滑液中EVs表面。事实上，一旦补体级联被激活，许多促炎产物就会释放出来，在胶原诱导关节炎模型中，注射抗C5单克隆抗体可抑制关节炎的发生，提示可能是补体与EVs相互作用导致RA炎症状态。有文献[20]报道，肿瘤移植到缺乏DNA结合核转录因子抑制物1表达的小鼠体内未能生长和转移，表明DNA结合核转录因子抑制物1参与了血管生成。Edhayan等[21]研究发现，在RA患者的滑膜成纤维细胞中，DNA结合核转录因子抑制物1包被在EVs中，且是成纤维细胞分泌的主要成分，激活内皮细胞c-Jun氨基末端激酶信号，在体外和体内产生促血管形成作用。因此，外泌体DNA结合核转录因子抑制物1可能是一种有用的治疗方法。除了DC和中性粒细胞衍生的外泌体具有治疗作用外，还有口服牛乳源性EVs可减轻胶原诱导型关节炎模型炎症的报道。由此预测，外泌体自身不仅可作为治疗药物，而且可作为结合药物的载体，满足精准治疗的需求。

综上所述，外泌体在RA的治疗中显示出了巨大的优势和潜力。外泌体相比其他在生物体液如血清或尿液中发现的生物标志物，表现出较高的特异性和稳定性。这使得外泌体中的蛋白质及IncRNA成为研究热点。目前外泌体的分离手段很难获得十分纯净而且单一的外泌体样品，并且没有任何一个单一实验可以确定外泌体的存在。故未来的研究将需要开发标准化的EV分离和量化技术。RA血液衍生外泌体对破骨细胞的分化有明显抑制作用，是人类破骨发生的新调节因子，那外泌体是如何选择性表达某种信号分子仍需要大量的研究来解释。当然，外泌体还参与免疫抑制细胞的免疫抑制和活化，调节抗原的表达，诱导T细胞凋亡。深入了解两者之间的联系有利于为将来诊断和治疗RA提供创新性线索。