嘌呤能受体2X4在中枢神经系统中的表达及意义

龚巧珠 罗仕妍 罗明 涂丽华

南昌市卫生学校解剖生理教研室（南昌330006）

嘌呤能受体2X（purinoceptor 2X，P2X）为非选择性阳离子通道，目前已克隆7种基因编码的P2X亚基（P2X1⁃7）[1⁃2]。研究[1，3⁃4]证实，P2X 受体通过细胞外三磷酸腺苷（adenosine 5’⁃triphosphate，ATP）的激活从而参与调节健康和疾病的生理病理过程，细胞外ATP可作为神经系统中大多数神经的唯一神经递质或重要的共同神经递质[4]。例如，在生理条件下，星形胶质细胞和神经元释放少量的ATP可作用于表达在神经元和神经胶质细胞上嘌呤受体产生生物学效应，健康组织细胞释放的ATP可调控终止嘌呤能信号传导的细胞表面核苷酸酶[5]，而受损细胞释放的ATP可以启动炎症反应并通过嘌呤受体进一步放大并维持细胞介导的免疫反应[6]。研究[7]显示，嘌呤能受体 2X4（Purinoceptor 2X4，P2X4）涉及神经性疼痛、炎性疼痛、癫痫、肺表面活性物质分泌、酒精摄入和偏好、吗啡诱导的痛觉过敏和心功能，暗示P2X受体在干预突触传递、味觉、疼痛感觉和炎症等病理生理过程中具有一定的药理学作用和临床意义。

1 P2X4在中枢神经系统中的表达与功能

P2X4为最初从大鼠脑cDNA克隆，且是在中枢神经系统神经元和血管中检测到的第一个P2X。随后从人类大脑中克隆了P2X4，并且还发现其在广泛组织中表达。在P2X亚型中，P2X4与P2X2和P2X6一起已被证明是中枢神经系统中最广泛和大量表达的功能性ATP门控嘌呤能受体，在大多数神经元和神经胶质细胞中被发现[8]。通过原位杂交、免疫组织化学、PCR和免疫印迹等技术，已经在mRNA和蛋白质水平上加以证实。

1.1 P2X4在中枢神经系统神经元中的表达与功能在中枢神经系统中，P2X4广泛表达在神经元。SOTO等[9]证实了在大鼠齿状回颗粒细胞、CA1/CA3锥体细胞、小脑皮层浦肯野细胞和脑桥核的神经元中表达有高水平的P2X4mRNA；电子显微镜分析表明，P2X4定位于突触后末梢的突触周围区域和突触前末端；免疫组织化学显示，P2X4在大鼠纹状体和黑质的γ氨基丁酸（GABA）能中间神经元和GABA能神经元中表达，P2X4对延伸至延髓头端腹外侧延髓的室旁核神经元以及调节交感神经活性的潜在作用；下丘脑和垂体前叶表达P2X4，可能参与调节中枢神经系统的下丘脑⁃垂体功能；室旁神经元、弓形核促性腺激素释放激素神经元和垂体前叶分泌细胞均表达P2X4；P2X4还被证明在泌乳素细胞、体感皮质神经元、神经节神经元、三叉神经元、前庭神经节神经元、视网膜神经节和双极细胞和脊髓神经元中表达。

P2X4涉及中枢神经系统的生理功能，包括对神经传递和突触强化的调节等。研究发现，在海马锥体神经元上的P2X4与突触可塑性和长时程增强有关，P2X4缺陷型小鼠中海马CA1区的突触易化和长时程增强诱导减少；P2X4的正变构调节剂依维菌素可增加野生型小鼠的长时程增强；下丘脑神经元P2X4的表达增加与GABA能电流的减少有关；P2X4与GABA（A）受体之间存在物理偶联，这可能在调节突触信号传导中发挥作用。因此，P2X4可能参与调节神经元中的兴奋性与抑制性神经传递，起到神经调质的作用。随着选择性药理学工具和更多基因敲除小鼠研究的发展，P2X4在这一过程中的贡献将来可能会变得更加清晰。

1.2 P2X4在中枢神经系统胶质细胞中的表达与功能在中枢神经系统中，P2X4在调节神经元和相邻神经胶质细胞之间的突触传递和通信中起作用。神经胶质细胞占中枢神经系统细胞总数的70%以上，可分为星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞三大类。研究证实，被称为是定居于中枢神经系统的巨噬细胞的小胶质细胞起源于卵黄囊，并与髓样免疫细胞有关，中枢神经系统P2X4在调节神经元和相邻神经胶质细胞之间的突触传递和信息联系中起作用；免疫组织化学分析揭示了大脑和脊髓内的小胶质细胞上有大量的P2X4反应性；外周神经损伤后，活化的脊髓小胶质细胞P2X4在转录、翻译和翻译后水平的表达上调，纤连蛋白和细胞因子干扰素γ可通过小胶质细胞中的IRF5转录因子调节P2X4的表达[10]；阻断脊髓P2X4受体或P2X4缺失，可减轻小鼠炎症和神经性疼痛，表明小胶质细胞P2X4在神经性疼痛发展中的重要性[11]。活化的小胶质细胞在脊髓损伤、中风以及阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性病变等疾病中起关键作用，暗示P2X4可能涉及这些疾病的发病过程。

另外，在星型胶质细胞和少突胶质细胞中也有P2X4的表达，并发挥一定的功能。星形胶质细胞为神经元提供各种功能支持，而少突胶质细胞是主要负责中枢神经系统中神经元髓鞘形成的神经胶质细胞。免疫染色显示，在大鼠海马中，特别是在CA1、CA3和齿状回区域中的S100阳性星形胶质细胞中表达P2X4，但在急性分离的小鼠皮层星形胶质细胞中，使用qRT⁃PCR未检测到P2X4mRNA表达，与电生理学研究显示的ATP诱导电流对正调节剂伊维菌素不敏感相一致。但在急性分离的皮质星形胶质细胞或海马脑片中未检测到P2X4介导的电流，说明P2X4反应并非普遍存在。同时在少突胶质细胞和少突胶质前体细胞中也已经证实包括P2X4在内的几种类型的嘌呤受体的表达。

1.3 P2X4在中枢神经系统血管中的表达与功能除了神经元和神经胶质细胞，中枢神经系统还有一个巨大的血管网络。P2X4在外周血管内皮细胞中的作用和血管张力的调节引起广泛关注。研究[12]显示，P2X4在外周血管内皮细胞中大量表达，同时在血脑屏障的构成中起重要作用的脑微血管内皮细胞亦有表达，脑血管内皮P2X4可能参与调节脑血管系统中的剪应力反应，并刺激骨桥蛋白等保护因子的分泌而形成缺血耐受。

2 P2X4亚细胞定位和下游信号通路

大多数P2X受体的细胞定位被认为主要在质膜上，且P2X4在许多细胞类型中的亚细胞分布显示具有重叠的细胞内囊泡标记的点状、簇状染色模式。研究表明，P2X4受体定位于质膜、涵体、溶酶体和空泡。XU等[13]使用P2X4⁃pHluorin进行体外运输研究，以量化和追踪亚细胞区域内的 P2X4分布；也有研究[14⁃15]证实，P2X4在溶酶体中起 ATP通道的作用，并通过钙调蛋白的Ca2+依赖性激活调控胞质内膜融合。

在ATP激活质膜中的P2X4通道后，阳离子（Na+和Ca2+）的快速流入将导致膜去极化，同时Ca2+的流入可能会触发重要的下游信号传导途径。例如，Ca2+在调节神经递质释放和各种小胶质细胞功能中发挥重要作用；P2X4能刺激小胶质细胞将信号传递给脊髓I号背角神经元，引起伤害性反应。研究发现，P2X4缺失小鼠的神经损伤后，脑源性神经营养因子在脊髓背角小胶质细胞中增多，显示ATP诱发的脑源性神经营养因子释放受损，暗示P2X4在控制小胶质细胞的脑源性神经营养因子释放中发挥重要作用。研究表明，p38丝裂原活化蛋白激酶激活和脑源性神经营养因子释放可作为导致神经损伤诱导的疼痛超敏反应的小神经胶质⁃神经元通信中的关键步骤；外周巨噬细胞也表达P2X4，触发Ca2+流入和p38丝裂原活化蛋白激酶磷酸化，进一步激活细胞溶质磷脂酶A2释放花生四烯酸和前列腺素E2从而导致外周伤害性通路的超敏反应和炎性痛的产生。

3 P2X4与中枢神经系统疾病

自20世纪90年代后期首次克隆P2X以来，关于P2X通道的表达和特征的认识不断被关注，P2X通道在正常生理功能和病理状态中的作用一直被讨论。如TSUDA等[11]发现P2X4在慢性疼痛和机械性异常性疼痛中的主要作用，通过缺乏P2X4表达的转基因小鼠的实验已经证实P2X4在调节疼痛信号传导中的作用。

3.1 P2X4与慢性疼痛慢性疼痛是指由于脊髓中疼痛处理途径的改变而引起的持续性疼痛，并且可表现为异常性疼痛、超敏反应或神经性疼痛[16]。目前认为P2X2/3，P2X7和P2Y1，P2Y2，P2Y12参与疼痛的调制[17]。研究发现，在神经损伤后，P2X4在脊髓小胶质细胞中上调，并介导触觉异常性疼痛；阻断P2X4或用反义寡核苷酸敲低P2X4可逆转异常性疼痛表型；P2X4缺失的小鼠在外周神经损伤后，其慢性炎性疼痛和异常性疼痛明显受到抑制，表明P2X4可能是此类神经性疼痛的潜在治疗靶点。脑源性神经营养因子被认为是能够使神经元敏感的一种促伤害性因子，且通过P2X4缺陷小鼠实验证实了P2X4介导脊髓小胶质细胞脑源性神经营养因子的分泌而产生痛觉过敏，表明小胶质细胞ATP⁃P2X4⁃脑源性神经营养因子轴是涉及疼痛阈值的中心路径[18⁃19]。

3.2 P2X4与酒精相关性疾病研究[20]表明，P2X4在涉及酒精和其他药物增强特性的关键脑区域中表达，在酒精诱导的行为中起作用，这可能通过调节中脑边缘多巴胺系统中的P2X4，通过激活大脑奖励系统而介导P2X4在酒精成瘾中的作用[21]。介导乙醇对P2X4门控影响的关键残基是Trp46、His241、Asp331和Met336。P2X4缺失的小鼠乙醇摄入量增加，表明P2X4基因可能与酒精摄入和（或）偏好有关[22]。研究[7]发现，嗜酒大鼠的P2X4基因表达低于酒精非嗜好大鼠，表明P2X4表达与酒精摄入量之间存在相关性。伊维菌素是一种广泛用于人类和动物的广谱抗寄生虫药物，可以拮抗乙醇对P2X4的抑制作用，并被认为会干扰乙醇与通道的结合。其他阿维菌素已经被证明以相似的方式起作用[23⁃24]。研究[7]发现，在中脑边缘系统的多巴胺能神经元中，P2X4可介导酒精饮酒行为。P2X4受体活性也与多巴胺能神经传递相关的其他行为有关，包括运动控制和感觉运动门控[21]。这些研究结果表明，酒精摄入可能通过乙醇作用于P2X4来调节，并且伊维菌素或阿维菌素类似物对P2X4的药理学作用可能会减少酒精消耗和偏好。

3.3 P2X4与神经炎症性疾病神经炎症主要是与免疫系统激活有关的脑和脊髓中的炎性变化[25]，被认为是由介质，如趋化因子、细胞因子和第二信使（如一氧化氮和前列腺素）所介导。脑内小胶质细胞可调节脑中细胞因子和炎性过程，通常促炎细胞因子和趋化因子的升高被认为是神经炎症的表现[25]。神经退行性疾病如阿尔茨海默病和帕金森病与神经炎症有关，小胶质细胞似乎发挥中心作用[26⁃28]。

研究[8]发现，多发性硬化模型动物脑内小胶质细胞P2X4的表达上调；在侧脑室注射脂多糖后，海马齿状回区域显示出被P2X4阻断剂阻断的小胶质细胞激活的典型特征[7]。酒精滥用诱导的神经炎症与脑内小胶质细胞P2X4受体上调有关[29]。另外，神经炎症反应也与大脑缺氧和局部缺血后小胶质细胞P2X4上调有关[12]。

总之，药理学新工具的发现，将有助于了解P2X4细胞的功能，这些工具可能为开发有益于治疗神经性疼痛的新药提供化学支架。由于选择性药理学工具的缺乏，P2X4的研究受到严重阻碍，选择性拮抗剂分子对P2X4的发现有助于进一步阐明其生理作用，有望为中枢神经系统疾病的治疗提供帮助。