细胞焦亡发生机制及其相关疾病的研究进展

石明霞,谢美玉,郭顺利,周素芳

(广西医科大学基础医学院, 南宁530021)

模式识别受体(PRR)与病原体相关分子模式(PAMP)的相互识别和作用是机体启动固有免疫应答的关键。PAMP是一类或一群特定的微生物病原体(及其产物)所共有的可被非特异性免疫细胞所识别的、高度保守的分子结构。PRR是一类主要表达于固有免疫细胞表面、能识别一种或多种PAMP的模式识别分子。炎症小体是一种由机体PRR参

与组成的多蛋白信号复合物，模式识别受体与特定配体结合，再与其他蛋白结合形成炎症小体复合物。每个炎症小体包含1个Caspase的激活和募集域(CARD)和/或1个热蛋白结构域(PYD)。Caspase-1与这些炎症小体通过结构域与结构域(PYD-PYD，CARD-CARD)结合的方式被激活。病原体入侵时，含有CARD结构域的炎症小体直接募集pro-Caspase-1，并使2个相邻pro-Caspase-1发生自身水解，产生具有酶活性的Caspase-1，活化的Caspase-1通过切割白细胞介素-1β(IL-1β)和 IL-18前体将其转化为活性形式并分泌至细胞外，最终诱发细胞焦亡[1]。不含CARD结构域的炎症小体，则通过含CARD结构域的凋亡相关斑点样蛋白(ASC)募集pro-Caspase-1[2]。非经典细胞焦亡通路则通过Caspase-4/5/11直接识别并结合细菌脂多糖(LPS)而激活。活化的Caspase-1/4/5/11将GSDMD蛋白切割为具有成孔活性的N端(GSDMD-N)，GSDMD-N在细胞膜上打孔引起细胞焦亡。现就细胞焦亡的分子机制、细胞焦亡相关疾病的研究现状及进展作一综述。

1　细胞焦亡与细胞凋亡的区别

细胞程序性死亡是机体免疫自稳的重要部分，能清除不需要的细胞。细胞凋亡与细胞焦亡均是细胞程序性死亡的方式，但二者在发生机制、细胞形态学及生物学效应等方面不同[3]。细胞凋亡由凋亡相关胱天蛋白酶(如Caspase-3/8/9)介导，细胞发生非炎症性坏死。细胞发生凋亡时，细胞质和细胞核固缩、DNA裂解、细胞膜保持完整。而细胞焦亡是炎性胱天蛋白酶( Caspase-1/4/5/11)介导的炎症性细胞坏死，细胞焦亡过程中细胞膜形成孔洞，细胞逐渐膨胀破裂，内容物释出，激发强烈的炎症反应[5]。

2　细胞焦亡激活机制

2.1经典细胞焦亡通路细胞焦亡通路中的PRR包括 NOD样受体(NLRs)NLRP1、NLRP3和NLRC4/NAIP及黑色素瘤缺乏因子2(AIM2)等[6]。ASC是一种接头蛋白，包含1个PYD和1个CARD结构域。NLRP1、NLRC4等炎症小体含有CARD结构域，可直接与Caspase-1结合，进行信号传导；仅含有PYD的炎症小体(如NLRP3、AIM2)需通过特殊接头蛋白ASC进行信号传导，ASC中的CARD可通过CARD-CARD相互作用募集Caspase-1[7]。

2.1.1细胞焦亡通路中的特殊接头蛋白ASC ASC是一种含有N端PYD和 C端CARD的接头分子。ASC含有的PYD结构域和CARD结构域通过自身的寡聚化来募集上下游与其含有同源结构域的其他蛋白(如NLRP3,Caspase)，形成一个稳定的蛋白复合物，即炎症小体，从而在经典的细胞焦亡通路中发挥重要作用。

2.1.2NLRP3炎症小体 NLRP3炎症小体属于NLR家族，由NLRP3、ASC及pre-Caspase-1组成[8]。NLRP3包含配体感应和自身调节的富含亮氨酸重复序列(LRRs结构域)；介导NLR寡聚化的核苷酸结合寡聚化结构域(NACHT)；以及调节下游信号传导的N端PYD结构域。NLRP3的PYD结构域能与ASC的PYD结构域结合，通过ASC的接头作用招募并激活Caspase-1。机体受到外来刺激时，NLRP3与ASC结合，并募集Caspase-1前体组装NLRP3炎症小体，同时活化Caspase-1，诱导细胞发生焦亡[3～6]。

2.1.3Pyrin炎症小体 Pyrin蛋白是由MEFV(地中海热)基因编码的含PYD的蛋白，能间接识别艰难梭菌，副溶血弧菌及其他肠道致病菌的细菌毒素/效应蛋白。不同于其他炎症小体， Pyrin并不直接识别和结合病原微生物分子，而是间接感受细菌的毒力而发挥作用。Pyrin主要通过感知各种细菌毒素对宿主细胞Rho家族小G蛋白的修饰和失活，进而以PYD-PYD结合的方式与ASC蛋白进行组装，形成炎症小体复合物，在介导细胞天然免疫中发挥重要作用[9]。

2.1.4NLRC4炎症小体NLRC4属于NOD样受体家族，主要感受细菌的鞭毛蛋白和Ⅲ型分泌系统等成分，在机体免疫应答中发挥重要作用[12]。病原体刺激时，处于静息状态的NLRC4会被NAIP亚家族蛋白识别并激活，从而发生自身多聚化并招募Caspase-1，形成炎症小体，引发一系列免疫应答效应[11]。NAIP是一类能直接识别和结合来自病原菌的不同配体分子的具有BIR结构域的新型NOD样受体分子。实验证明 NAIP5和 NAIP6能特异性识别并直接结合病原菌的鞭毛蛋白分子，然后通过和 NLRC4相互作用引发免疫应答[12]。NLRC4蛋白以“自我复制”的方式被激活并发生寡聚化，能敏感感知外界危险信号，快速启动免疫应答[13]。

2.1.5NLRP1炎症小体 小鼠表达3种同系物，NLRP1a、NLRP1b、NLRP1c，人类仅表达 NLRP1。NLRP1包含1个PYD结构域(位于N末端)、1个LRR结构域、1个功能发现结构域 FIIND和1个CARD结构域(C末端)，可与Caspase-1的CARD结构域之间直接结合，从而激活 Caspase-1[4]。

2.1.6AIM2和IFI16炎症小体AIM2和IFI16是ALR家族的成员，能诱导Caspase-1的活化和细胞因子IL-1β的成熟。AIM2是细胞质中细菌或病毒来源的dsDNA受体[14]。ALR炎症小体通过HIN-200结构域直接识别并结合其配体-dsDNA。细菌双链DNA结合后到AIM2的C端HIN200域，AIM2的N端中的PYD与ASC中的PYD相互作用，激活Caspase-1。IFI16同AIM2一样，不含CARD结构域，需通过 PYD来募集 ASC激活炎症小体[15]，且 IFI16可能在识别病毒双链DNA并促进干扰素γ的产生过程中发挥作用。

2.2非经典细胞焦亡通路 非经典细胞焦亡通路由Caspase-4/5/11引发。Caspase-4/5/11均属于炎症性Caspase家族，这类Caspase的CARD结构域能直接识别并结合 LPS，并发生自身寡聚化进而表现出明显的蛋白酶活性[16]。 LPS激活的Caspase-11/4/5在 N末端和 C末端结构域间的接头内切割 GSDMD， 从而释放具有成孔活性的 N端结构域(GSDMD-N)，GSDMD-N通过结合膜磷酸肌醇转移到质膜，在膜上穿孔引起细胞溶胀和渗透裂解。

Pannexin-1是缝隙连接半通道蛋白，控制浆膜上小分子物质进出。Pannexin-1在ATP诱导的针对LPS进行的免疫应答导致的细胞焦亡过程中起重要作用。在非经典炎症小体通路中Caspase-11的激活导致Pannexin-1的断裂和Pannexin-1依赖性ATP通道的开放，从而介导细胞焦亡[17]。裂解的Pannexin-1可打开自身通道以释放ATP，从而激活P2X7受体。P2X7受体是一种允许Na+和Ca2+内流的非选择性阳离子通道。受到ATP长时、反复刺激时，P2X7通道开放引起K+、Na+、Ca2+外流，细胞膜内外正常的离子梯度丧失，细胞发生肿胀破裂，最终发生细胞死亡[18]。而Pannexin-1是介导该通路的必需物质。在受到LPS刺激时，Pannexin-1的裂解一方面可能通过促进ATP释放激活P2X7受体形成非选择性质膜孔道诱发细胞死亡；另一方面可能由于钾离子外释激活了NLRP3炎症小体，引起Caspase-1的活化及IL-1β的释放从而在细胞焦亡中发挥作用[18]。

3　细胞焦亡过程中的关键蛋白

3．1 GSDMD蛋白在细胞焦亡中的作用 GSDMD是一种表达于免疫细胞和小肠黏膜上皮细胞表面，由242个氨基酸组成的蛋白，是所有炎性Caspase的共同底物，是细胞焦亡的直接执行者。GSDMD被活化的炎性Caspase切割成具有成孔活性的N端(GSDMD-N)和具有结构自抑作用的C端(GSDMD-C)。GSDMD-N能特异性与细胞膜结合导致细胞膜穿孔，一方面含有细胞膜的病原体因细胞膜的破坏直接导致死亡；另一方面宿主细胞膜破裂后病原体被释放到内环境中，被宿主的免疫系统识别杀伤。同时，GSDMD还能影响炎性细胞因子IL-1β/18的释放，从而在细胞焦亡中发挥作用。

GSDMD是细胞焦亡过程中不可或缺的物质[19]。GSDMD蛋白是所有炎性Caspase的共同底物蛋白，细胞焦亡过程中GSDMD被炎性Caspase切割裂解成GSDMD-N和GSDMD-C，GSDMD-N具有亲脂性和成孔活性，能诱导细胞焦亡，GSDMD-C具有亲水性，通过与N端结合发挥自抑作用。GSDMD属于Gasdermin蛋白家族，该家族还包括GSDMA、GSDMB、GSDMC、DFNA5、DFNB59等[20]。研究人员发现几乎所有的Gasdermin家族蛋白的N端结构域都具有诱导细胞焦亡的功能。Gasdermin N端结构域结合细胞上的脂质和在膜上打孔进而破坏细胞膜是其诱导细胞焦亡的分子基础[21]。细胞焦亡时GADMD被切割并发生低聚化。GSDMD-N不会从细胞膜外破坏细胞的活性，而是选择性地与质膜的内膜及细菌的膜结合，破坏细胞膜的屏障，引起细胞膜渗透性紊乱，最终导致细胞溶胀破裂。Chen等[23]从另一角度验证了DSDMD的打孔特性。

3.2GSDME蛋白在细胞焦亡中的作用GSDME与GSDMD蛋白同属Gasdermin蛋白家族。在TNF-α或肿瘤化疗药物的作用下，GSDME被Caspase-3切割并激活后，诱导肿瘤细胞发生细胞焦亡而非细胞凋亡。断裂后的GSDME-N具有打孔活性，能靶向作用于细胞膜，在细胞膜上形成孔洞，从而诱发细胞焦亡。当突变切割位点D270A后，则不能发生细胞焦亡。同样，敲除Caspase-3后，细胞焦亡现象被抑制，细胞通过Caspase-7的介导进入细胞凋亡。GSDME在化疗药物杀伤肿瘤的过程中发挥重要作用。GSDME在正常组织中均有表达[22]，在多数肿瘤细胞中，由于启动子区的DNA甲基化，GSDME的表达被抑制，对于GSDME表达较低的细胞，DNA甲基化酶抑制剂地西他滨能显著提高GSDME表达，将地西他滨和化疗药物(阿霉素等)联合用药，对肿瘤细胞的杀伤效果明显增强。GSDME在增强化疗药物疗效的同时，伴随多种器官的损伤，说明GSDME在化疗药物的不良反应中发挥重要作用[22]。

4　细胞焦亡相关疾病

正常情况下，机体的免疫系统能识别“自己”和“非己”，在遭受病原体入侵时会启动免疫应答以清除“异己”，保护“自己”。正常的免疫应答对机体是有益且必要的，但机体在清除病原体的同时亦会对“自体”造成损伤，这种损伤一旦过度甚至发展为不可控制时则会引发相关疾病。

4.1感染性疾病人体内Caspase-4/5是LPS的免疫受体，受到病原菌感染后，机体启动非经典细胞焦亡途径进行免疫应答。细胞焦亡有利于机体清除病原微生物以防御伤害，但同时大量炎性因子的募集和释放导致炎症反应被无限扩大，可能造成内毒素性休克等更严重的症状[14]。伤寒沙门杆菌、肺炎链球菌、胸膜肺炎放线杆菌、白色念珠菌、耐药性金黄色葡萄球菌等均能诱导细胞焦亡[23]。

4.2痛风痛风患者滑膜与关节液中IL-1β和IL-18明显增高，与尿酸水平呈正相关，且IL-1阻断剂治疗痛风疗效明显，可能是由于尿酸结晶激活了NLRP3炎症小体，引起IL-1β和IL-18的大量释放促使细胞发生焦亡[24]。

4.3免疫缺陷疾病近年来发现在被SIV、HIV病毒感染后，CD4 T细胞发生了细胞焦亡，细胞焦亡引起的炎症级联反应将募集更多的同类免疫细胞，不受控的细胞焦亡很可能是免疫缺陷病毒对机体免疫系统造成严重破坏的机制之一[25]。

4.4自身免疫性疾病研究发现白癜风、Addison病、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病与 NLRP1炎症小体介导的细胞焦亡有关，NLRP1炎症小体通过上调IL-1β的加工在免疫损伤中扮演重要作用[26]。炎症性肠病的发病亦与细胞焦亡密切相关。另外，动脉粥样硬化、阿尔茨海默病和肌萎缩侧索硬化、肺损伤、心力衰竭、代谢综合征和2型糖尿病等疾病的发生发展过程亦伴随有细胞焦亡的发生。

综上所述，细胞焦亡是机体遇到外界刺激时应答过度引发的不可控炎性损伤。GSDMD是炎性Caspase诱导细胞焦亡的直接执行者，Caspase-3激活的GSDME介导的细胞焦亡会增强化疗药物的疗效，但亦与其不良反应密切相关。诸多疾病伴随有细胞焦亡现象的发生。

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