加入去甲肾上腺素培养的心肌细胞株H9c2体积变化

唐敬，付强强，陈梦青，李春梅，陆家政

( 1 广东药科大学药学院，广州 510006；2 广东药科大学基础学院)

心肌肥厚是心脏的一种较为有效的代偿功能，是心脏为了适应各种刺激而产生的心肌细胞体积增大、重量增加，可加强心肌收缩力，维持正常的心脏功能。心肌肥厚主要发生在心脏长期压力负荷过重的情况下，但长期持续刺激可导致病理性心肌肥厚，肥大的心肌需氧量增加，而冠状动脉的供血量往往不足，导致心肌缺血、心率失常、心肌收缩力减退，进而诱发急性心衰，增加患者猝死几率[1 ,2]。心房钠尿肽(ANF)是由心房肌细胞合成并释放的肽类激素，可使血管平滑肌舒张和促进肾脏排钠、排水，是目前临床公认的心肌肥厚标志物。目前病理性心肌肥厚的形成过程及其具体分子机制尚不明确。研究[3 ,4]发现，病理性心肌肥厚的形成与肾上腺素能受体的持续激动密切相关。去甲肾上腺素(NE)是一种较为强烈的α -肾上腺素能受体激动剂，研究发现其长期作用于人体可导致心肌细胞肥大[5]，但其具体机制尚不清楚。氯通道蛋白3(ClC-3)是电压门控氯通道基因家族成员之一，可维持细胞容积的稳定。ClC-3高表达于心脏组织，对于维持心脏正常结构和功能有重要作用。目前关于但与心肌肥厚形成的关系尚不明确。2016年6 ～ 12月，我们观察了NE对心肌细胞系H9c2细胞体积的影响，并探讨其可能作用机制，旨在为心肌肥厚的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 药品、细胞及试剂 NE购自美国Sigma公司。心肌细胞株H9c2购于中山大学，于含1% 双抗、10% 类胎牛血清的DMEM培养基中培养。Countstar自动细胞计数仪购自Shanghai Ruiyu Biotech Co, Ltd，类胎牛血清、DMEM高糖培养基、购自美国Gibco公司，胰酶购自美国Sigma公司，TRIzol试剂购自TaKaRa生物公司，Prime ScriptTMRT Reagent、SYBR PCR Mix购自ToYoBo公司，ClC-3抗体购自美国Abcam公司，CFXTM系列Real-Time PCR仪购自Bio-Rad公司，Applied Biosystems®2720 Thermal Cycler购自美国Thermo Fisher Scientific公司。引物由上海生工生物工程股份有限公司设计并合成。

1.2 H9c2细胞培养及NE给予方法 取对数生长期H9c2细胞计数后种板，置于5% CO2、37 ℃培养箱中培养过夜，待细胞贴壁后用PBS清洗3次，换用无血清培养基饥饿细胞24 h。将细胞随机分为实验组和对照组，分别加入终浓度为2 μmol/L的 NE、等体积PBS，继续培养48 h。

1.3 细胞体积检测 取两组细胞，PBS洗3次，0.25%胰酶消化，终止消化后，吹打混匀，通过Countstar自动计数仪测量细胞直径，每组选3个视野测量，可得到细胞直径(d)，按球体体积公式V=4/3π(d/2)3计算细胞体积，取平均值。

1.4 细胞ANF mRNA检测 采用RealTime-PCR法。取两组细胞，TRIzol法提取细胞总RNA，经TGEM Plus全波长分光光度计测定核酸浓度及纯度。用试剂盒方法逆转录为cDNA，进行目的基因的扩增和分析。以GAPDH为内参。引物序列如下：ANF上游引物5′-GGAAGTCAACCCGTCTCA-3′；下游引物：5′-AGCCCTCAGTTTGCTTTT-3′；GAPDH上游引物：5′-AGGAGTAAGAAACCCTGGAC-3′；下游引物：5′-CTGGGATGGAATTGTGAG-3′。扩增条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，Plate Read，循环40次，Melt curve 55 ℃-95 ℃，每隔0.5 s，维持2 s，95 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min。以2-ΔΔCt代表目标基因的相对表达量。

1.5 细胞ClC-3蛋白检测 取两组细胞，PBS清洗3次，加入固定液室温固定细胞15 min，PBS洗涤3次后加入封闭液，室温下孵育1 h。除去封闭液，加入ClC-3抗体(1∶300)，4 ℃孵育过夜。再除去一抗，PBS洗涤3次后加入二抗，室温避光孵育1 h，最后除去二抗，加入细胞核染色剂(DAPI)，染核3 min。用荧光显微镜观察并于相同条件下拍照。图片用Image Pro Plus软件分析两组平均光密度(AOD)值，以AOD值代表ClC-3蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 两组细胞体积比较 实验组、对照组细胞体积分别为(2446.0±193.3)和(1736.0±265.6)μm3，二者比较，P<0.05。

2.2 细胞ANF mRNA相对表达量比较 实验组、对照组ANF mRNA分别为1.63±0.14、1.00±0.13，二者比较，P<0.05。

2.3 两组细胞ClC-3的AOD值比较 实验组、对照组细胞ClC-3的AOD值分别为0.261±0.062、0.660±0.107，二者比较，P<0.05。

3 讨论

心肌肥厚是心血管意外事件的一个重要的危险因素，主要的病理变化表现为心肌重构，包括心肌细胞肥大、心肌间质细胞增殖及心脏细胞外基质改建等多方面的改变，同时会导致心肌细胞的氧化应激压力及细胞容积的增加，扩张心肌细胞的细胞膜，进而改变细胞容积稳态平衡及许多细胞功能[6]，最终会导致心衰，致使患者死亡。临床上多种心脏疾病都能观察到心肌肥厚的发生，但其发生的机制十分复杂，儿茶酚胺、遗传、机械性因素、神经体液因素、细胞因子、血流动力学等都被认为与其有密切关系。

肾上腺素能受体是一类介导儿茶酚胺作用的受体，有文献[7 ,8]报道，肾上腺素能受体的持续激动可直接导致病理性心肌肥厚的形成。NE是交感神经系统中较为重要的神经递质，主要由交感节后神经元和脑内肾上腺素能神经末梢合成和分泌，主要激动 α1和α2 受体，心脏中 α1受体大约占肾上腺素受体总数的10%[8]，对于维持心脏功能的正常有重要作用。α1受体在心肌肥厚的形成过程中起重要作用。心脏中主要存在 α1A和 α1B两种亚型，心脏 α1A 过表达和 α1B过表达的小鼠都会直接表现出心肌肥厚[9]，但具体作用机制尚不清楚。本研究发现，实验组细胞体积增大，细胞表现出肥大反应。α1 受体的持续激动会导致一些胚胎基因的重新表达，例如ANF、骨骼肌α-肌动蛋白和β-肌球蛋白重链等，本实验结果显示，NE作用于H9c2细胞后，实验组细胞ANF的mRNA水平明显高于对照组。α1 受体调控的心肌肥厚的机制目前尚不完全明确，肾上腺素能受体属于G蛋白偶联受体，可能通过其下游PLC、PKC、MAPK和ERK等信号通路发挥作用，在 α1 受体激动所致细胞及动物心肌肥厚模型中，都能明显检测到上述通路的激活。也有文献[10]报道，α1 受体激动所致的心肌肥厚也与多种细胞转录因子如GATA-4、STAT3等有关，GATA4 的磷酸化与 α1 受体激动所致的心肌肥厚密切相关，STAT3过表达能逆转 α1 受体激动引起的心肌细胞肥大。最近有研究发现，α1 受体通过调控白细胞介素6的分泌来调控心肌肥厚。有体内实验[11]发现，腺苷酸A1受体激活能改善 α1 受体激动所致的心肌肥厚及心肌纤维化。这些研究表明，α1受体在心肌肥厚的发生过程中有重要作用，但其机制十分复杂，尚不完全明确。此外，α1 受体与氯离子的分泌、运输及氯电流的产生密切相关。在牛视网膜色素上皮细胞中，α1 受体调控钾以及氯的运输，棕脂肪细胞的 α1 受体持续激动会激活钙敏感氯电流。

ClC-3是电压门控氯通道基因家族成员之一，在包括人类在内的许多生物体内大量表达，生物功能多样，参与了细胞的增殖、分化、迁移、凋亡[12 ～ 14]。有研究表明，ClC-3在心脏心房和心室细胞、血管平滑肌细胞及内皮细胞等的含量十分丰富，被认为是心肌细胞及血管平滑肌细胞容积调节性氯离子通道(VRCCs)的分子结构基础[15 ,16]。容积调节是正常细胞的基本生理功能，能够在细胞微环境改变时维持细胞容积的稳定，这对于细胞的生存是必不可少的，还可以影响到许多生理病理过程[17]。许多研究从药理、生物等方面已证实ClC-3的容积调节作用，当细胞容积增大时，ClC-3通道开放，容积敏感性氯电流(ICl,swell)激活，大量Cl-外流，同时大量水分外流，细胞容积恢复。这对于心脏缺氧、局部缺血或心肌肥厚导致的心肌细胞容积改变有很大的保护作用。有文献报道，在多种实验动物模型如心力衰竭犬模型、心力衰竭兔模型、心肌肥厚小鼠模型等发现ICl,swell的激活[18]。在临床心肌肥厚患者心肌细胞中也能检测到ICl,swell的激活[19]。这些研究结果预示着ICl,swell的激活是心肌细胞对于心肌肥厚或心衰导致的心肌重构的一个基本反应。最近有研究[20]发现，特异性敲除成年小鼠心脏的ClC-3基因会加速心肌肥厚的形成过程，超声心动图结果显示，心脏特异性ClC-3基因敲除鼠与正常同年龄的野生鼠相比，前者能够发现显著的心肌肥厚及心力衰竭指标。之前亦有研究[21]发现，在兔心肌细胞中，发生心力衰竭时ICl,swell电流密度减少。这些实验结果都预示了ClC-3在心肌肥厚的形成及维持心脏功能中的重要作用,当ClC-3表达降低时，ClC-3通道减少，ICl,swell电流密度降低，细胞容积调节能力减弱，导致细胞体积增大。本研究结果显示，实验组细胞ClC-3蛋白水平相对于对照组显著降低，表明ClC-3的降低与NE所致的H9c2细胞肥大有一定关系。

综上所述，NE可导致H9c2细胞体积增大，可能与其上调ANF mRNA表达、抑制ClC-3蛋白表达有关。

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