经典Wnt信号通路与结肠肿瘤干细胞关系的研究进展

朱生琳，朱蓉，赵逵

(遵义医学院附属医院，贵州遵义563000)

结肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，其病死率位居癌症的第3位[1,2]。随着我们国家日新月异的经济发展和生活习惯的改变，结肠癌的发病率呈现逐年递增的趋势，因此对结肠癌的防治研究迫在眉睫。肿瘤干细胞(CSC)是肿瘤少量具有自我更新、多向分化潜能及无限增殖和异质性的细胞亚群[3]，可为肿瘤的发生、发展、转移以及为最新的靶向治疗提供理论基础。Wnt信号通路对细胞发育分化、修复起着关键的调控作用，是细胞生长、分化的起始信号。Wnt信号通路主要有Wnt/β-catenin、Wnt/PCP、Wnt/calcium 3种传导方式[4]，其中Wnt/β-catenin是经典Wnt信号传导通路，主要调控细胞的增殖能力。大量研究表明，经典Wnt信号通路参与CSC的分子调控，破译其关系也许可以从根源上遏制肿瘤的发生、发展及转移，对肿瘤防治有重要意义。本文就经典Wnt信号通路与结肠CSC存在的信号级联关系综述如下。

1 经典Wnt信号通路对结肠CSC生成的调控

研究认为，CSC可能来源于干细胞发生特定的基因突变，成为具有无限增殖能力的异质性细胞。大量实验显示，在自我更新和多向分化潜能方面，肠道干细胞(ISC)与结肠CSC具有类似的生物学特性。例如，二者有相同的标记物Lgr5、CD133、CD44。结肠干细胞在肠道隐窝基底部沿着“隐窝”-“绒毛”轴不断的分化向上迁移，从而维持了肠道组织的稳态平衡和自我更新；并且，研究发现β-catenin在结肠隐窝基底部的表达最强，并沿着“隐窝”-“绒毛”轴由强渐弱[5]。因此，经典Wnt信号通路对于ISC调控细胞的起始增殖分化有着重要的作用。研究显示，敲除转基因新生小鼠的T细胞转录因子4(TCF4)、选择性抑制转基因小鼠中经典Wnt通路的激活，或者选择性切除β-catenin或TCF4片段，都可使肠道隐窝内ISC锐减。因此，隐窝内环境的稳态和ISC自我更新都离不开经典Wnt通路的激活传导[6～8]。

CSC是构成肠道肿瘤组织的一小部分，其角色相当于正常组织里面的ISC，而CSC就相当于肿瘤细胞起始的“种子”。根据其相似的生理功能，在肠道中提出了“自上而下”和“自下而上”两种假设模型。“自上而下”模型认为，结肠CSC是由部分已分化的细胞重新获得类干细胞样的特性，发展为肿瘤并在隐窝部产生异常病灶；“自下而上”模型认为，结肠CSC是隐窝基底部的干细胞发生基因突变，向外扩、张向上迁徙成为肿瘤的起始“种子”。这两种模型都受经典Wnt信号通路的调控：①在“自上而下”模型中，超活化的β-catenin-TCF信号可使分化的肠道上皮重新获得多能性，从而形成新的不受调控的类隐窝结构，随后发生腺瘤[9]。在结肠顶端早期腺瘤的观察中发现，已分化细胞是结肠CSC致瘤性转化的“种子”起源细胞；在肠道肿瘤的转基因小鼠模型中显示，已分化的上皮细胞具有能重新获得类干细胞样的功能[10]，通过联合激活经典Wnt通路和核因子κB(NF-κB)信号可获得肿瘤细胞特性[11]。②在“自下而上”模型中，对早期散发的结肠腺瘤免疫组化研究显示，腺瘤病变部位靠近隐窝基底部，病变部位β-catenin在核内的积聚，维持了其对应的表皮细胞β-catenin在亚膜间隙的连接[12]。在结肠腺瘤性息肉病基因(APC)缺失的结肠隐窝基底部干细胞，可被迅速诱导转化为结肠微腺瘤。这表明增加Lgr5+干细胞舱中经典Wnt的活性，可诱发产生结肠CSC[13]。以上研究都表明，经典Wnt信号过度活化是干细胞舱中致瘤性转化至关重要的因素，而肠道上皮在慢性炎症等条件下增加NF-κB信号也同样可使细胞去分化。另外，由于经典Wnt信号通路的过度活化，也可导致隐窝基底部的ISC产生基因突变转化为肠道CSC。

2 Lgr5是经典Wnt信号通路诱导结肠CSC产生的标志

Lgr5是经典Wnt信号通路的靶基因，同时也是ISC和CSC常见的表面标记[14]。在小鼠结肠癌模型的研究中显示，在经典Wnt信号通路过度活化(敲除APC基因)模型中，肠道中的Lgr5+亚群导致了结肠腺瘤的形成[15,16]。因此，Lgr5+细胞被认为是肿瘤的初始细胞。在实验中结合ISC所具有的生物特性，可通过Lgr5细胞表面标记物，将结肠CSC从结直肠癌(CRC)组织中分离出来。高表达Lgr5的CRC细胞在试管中的增殖具有更强的克隆能力，而抑制Lgr5的表达会导致其丧失形成集落的能力[17]。高水平的Lgr5-ISC肿瘤基因特性是更具侵袭和转移能力，也揭示了CRC患者的高复发趋势[18]。在19种公认的干细胞标记中，Lgr5在人体CRC样本中有74%普遍表达率，Lgr5和Ascl2以及其他基因一起共表达，印证了腺瘤来源于Lgr5+/Ascl2+隐窝干细胞这一假设。对CRC经手术治疗复发患者的研究显示，Wnt信号通路靶基因(Lgr5、Ascl2、Axin2、Dkkl和Apcdd1)的表达与疾病复发呈负相关，经典Wnt信号通路靶基因高表达与良好的预后密切相关[17]。基于对CRC细胞系的研究发现，这些经典Wnt靶基因可被CpG甲基化选择性沉默。因此，在结肠CSC中经典Wnt靶基因甲基化，可导致CRC复发概率增高。

3 由经典Wnt信号通路诱发的结肠CSC参与CRC的转移

研究发现，在肿瘤组织侵袭前细胞核中表达出高水平β-catenin。这些细胞是通过上皮间质转化(EMT)而来的，具有更强的增殖能力和侵袭力，意味着经典Wnt信号通路诱导CSC在转移中扮演着重要角色。大量研究表明，EMT在CSC增殖中起着关键的管理调控机制，尤其表现在乳腺癌细胞系中。同样的在CRC中，EMT影响着其恶性程度与远端转移，包括结肠CSC的增殖、肿瘤的发育、循环肿瘤细胞以及耐药性[19]。结肠CSC具有的自我更新和分化能力，使其可以更好地去调节适应肿瘤转移的各种不同阶段。在具有过度活化的经典Wnt信号通路的晚期结肠肿瘤CSC细胞中发现，Lgr5的表达与CRC肿瘤细胞株的恶性潜能联系密切。在高表达的Lgr5结肠肿瘤中，其肿瘤分期越高、侵袭性更强、淋巴结转移概率更大[20]。随着研究的深入，“迁徙肿瘤干细胞(MCSCs)”假设被提出，由结肠CSC参与的结肠肿瘤转移是转移的主要驱动力[21,22]。根据该实验模型，结肠CSC内在的适应性导致了结肠癌获得更强的侵袭性，可通过血液以及淋巴管迁徙至远端的器官，从而发展至肿瘤晚期阶段。新形成的转移瘤和同源的原位癌有着高度相似基因和蛋白，这表明定植后的MCSCs可重新转化为它们最初的表型[23]。在与具有原位CRC细胞组织和肝转移患者的基因表达中发现，Ascl2在转移瘤以及一些经典Wnt信号通路诱导的ISC中表达上调，其他还包括Lgr5、EphB3、Ets2、Smoc2[24]和Sox9[23]。

4 以经典Wnt信号通路为靶点抑制结肠CSC

在靶向药物的研究中，我们可从4个方面来调控经典Wnt信号通路继而影响结肠CSC的增殖、分化与转移。①在细胞外及细胞膜方面，激活经典Wnt信号通路可以影响Wnt配体、Fzd、LRP5/6、Wnt抑制因子、dikkopf以及Frizzled家族分泌蛋白的表达水平。②在细胞质方面，通过干预APC、Axin、β-catenin以及激活状态的环氧化酶(COX)-2的表达水平，可以影响β-catenin在细胞内的累积量和稳定性。③在细胞核方面，LEF/TCF的转录、AMP应答因子结合蛋白CBP、c-myc以及D1同样调控结肠CSC的增殖和分化。④其他信号通路同样也能作用于经典Wnt信号通路，对结肠CSC产生不同程度的影响。

非甾体抗炎药(NSAIDs)已经证实对于肿瘤具有抑制作用，并且已成为重要的结肠癌化疗药物。其作用机制主要是通过抑制COX中的关键信号花生四烯酸，但不同的NSAIDs抑癌机制不同。例如，阿司匹林、塞来昔布通过抑制经典的Wnt信号通路发挥抑癌作用。塞来昔布选择性抑制COX-2，并且在经典Wnt信号通路中降低TCF，这一机制被用于治疗家族性腺瘤息肉病。近年来，研究发现使用塞来昔布的APC患者中70%可降低肠息肉的形成[25]，这给结肠癌的治疗指出新方向。实验中NSAIDs能够诱导人结肠息肉细胞凋亡，并在APCMin/+小鼠[26]中能够有效清除ISC的异常Wnt信号。其机制是激活APC缺失细胞中的Bcl-2同源结构3域，相继导致c-myc的激活[27]，进一步揭示了NSAIDs在肿瘤中可诱发凋亡信号。

综上所述，经典Wnt信号通路对体内动态平衡和发展起着重要的作用，参与生长发育、分化等多种复杂的生理过程；该通路同样也是ISC的主要调控器，对肠道肿瘤的发生发展起着至关重要的作用。现阶段在结肠干细胞基础上提出了CSC理论，并发现经典Wnt信号通路和CSC及Lgr5、Ascl2、Axin2、Dkkl和Apcdd1等多种经典Wnt信号通路靶基因及CSC标记的表达与肿瘤的转移和复发存在关联。但是，肠道肿瘤的发生、发展、转移是连续性、多环节、多过程的生化过程，其作用机制至今尚未明确，有待进一步的研究和探索。

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