中国荷斯坦牛CSN3基因多态性及其与泌乳性状的关联性

胡 言，桂林生，余横伟，Haider Abbas Raza，昝林森,2(西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌7200；2现代牛业生物技术与应用国家地方联合工程研究中心，陕西 杨凌7200)

泌乳性状的选育是奶牛育种的重要内容之一，因为其直接决定着奶牛养殖的经济效益。乳成分包括乳脂、乳蛋白以及乳糖等，而乳蛋白分为酪蛋白(Casein)和乳清蛋白两大类[1]，其中酪蛋白含有大量的钙和磷，属于特有的一种磷蛋白，按照生化性质分为αs1酪蛋白(CSN1S1)、αs2酪蛋白(CSN1S2)、β酪蛋白(CSN2)、κ酪蛋白(CSN3)和γ酪蛋白(γ Casein)5种亚型[2]。牛CSN3基因位于第6号染色体上，基因全长2 554 bp，含1个外显子，其中编码序列(Coding sequence，CDS)长483 bp。有研究证实，CSN1S1、CSN1S2、CSN2和CSN3基因在牛6号染色体q31～33位置上紧密连锁[3]，显著影响牛奶中的乳蛋白率、乳脂率和产奶量等性状[4]。

在山羊上的研究发现，CSN3基因多态性与产奶量、乳品质、繁殖力等有一定的相关性[5]。在小鼠模型上，敲除CSN3基因后发现，尽管其它酪蛋白表达量未发生变化，但母鼠却丧失了泌乳能力，说明CSN3基因在泌乳过程中发挥着重要的调控作用[6]。此外，κ酪蛋白是大部分哺乳动物中唯一的糖基化酪蛋白，水解后产生的配糖巨肽可以预防胎儿对外源性蛋白过敏[7]，还能为其提供氨基酸和碳水化合物[8]。

牛CSN3基因位于第6号染色体上，基因全长2 554 bp，含1个外显子。基于CSN3基因在泌乳过程中的重要调控功能，本研究采用DNA测序法，对565头中国荷斯坦牛CSN3基因进行群体变异检测分析，将检测到的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)位点与中国荷斯坦牛的泌乳性状进行关联性分析，同时分析不同双倍型对中国荷斯坦牛泌乳性状的影响，以期为中国荷斯坦牛分子育种提供新的理论方法和技术途径。

1 材料与方法

1.1 血液采集及泌乳性状指标的获取

供试血样采自陕西省华阴市的西安草滩牧业有限公司华阴奶牛一场。采样时，随机选择健康的中国荷斯坦牛母牛565头，每头牛尾静脉采血10 mL，样品采集完毕后置于-80 ℃保存。荷斯坦牛胎次信息及DHI数据均来自采样牛场资料库，本试验选用DHI指标包括乳脂率、乳蛋白率及乳糖率。

1.2 中国荷斯坦牛CSN3基因的PCR扩增

外显子区域的SNP可能会引起氨基酸结构发生改变，进而影响基因的翻译；3′UTR区域SNP可能改变MicroRNA结合，导致基因的转录水平发生改变。故本试验针对CSN3基因外显子和3′UTR区域设计引物。根据GenBank公布的牛CSN3基因序列(GenBank登录号：NM_174294.2),利用Primer 5.0软件设计引物(表1)，交由上海生工生物工程股份有限公司合成。由于CSN3基因3′UTR区域全长2 071 bp，无法一次进行扩增，因此设计2对引物进行分段(3′UTR1和3′UTR2)扩增。

表1 CSN3基因引物序列信息Table 1 Sequence information of primers for CSN3 gene

使用TIANamp Blood DNA kit试剂盒(天根，北京)提取DNA。DNA质量和浓度分别采用0.5%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计法进行检测。CSN3基因PCR反应体系为30.0 μL：含有核酸染料的dNTPs、TaqDNA聚合酶、10×Buffer的Mix共计15.0 μL，ddH2O 11.8 μL，上、下游引物各(10 pmol/μL)0.6 μL,模板DNA(50 ng/μL)2.0 μL。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，退火30 s(退火温度见表1)，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.3 SNP检测

将扩增好的PCR产物送至上海生工生物工程股份有限公司进行纯化并测序，测序结果使用DNAMAN软件进行对比分析，筛选突变位点。本试验中的CSN3基因3′ UTR区域所扩增的2个片段分别独立分析。

1.4 数据统计与分析

2 结果与分析

2.1 CSN3基因外显子和3′ UTR的PCR产物检测结果

图1、2为CSN3基因外显子、3′ UTR1和3′ UTR2的PCR扩增结果，其片段长度分别为375，905和511 bp。结果显示，扩增产物电泳条带清晰，特异性较好，可以用于后续测序分析。

M.DNA Marker;1,2.外显子扩增产物M.DNA Marker;1,2.PCR product of exon图1 中国荷斯坦牛CSN3基因外显子PCR产物的电泳检测Fig.1 Electrophorogram of PCR product of exon1 in CSN3 gene of Chinese Holstein Cattle

M.DNA Marker;1,2.3′ UTR1;3,4.3′ UTR2图2 中国荷斯坦牛CSN3基因3′ UTR分段PCR扩增产物的电泳检测Fig.2 Electrophorogram of PCR product of 3′ UTR in CSN3 gene of Chinese Holstein Cattle

2.2 CSN3基因多态位点的遗传学分析

通过测序分析发现，CSN3基因外显子上存在1个SNP位点，为g.463A>G(图3-A);在3′UTR区域存在3个SNPs，分别是g.1012A>C(图3-B)、g.2015T>A(图3-C)和g.2396A>T(图3-D)，尽管这3个SNP位点均不能改变氨基酸结构(同义突变)，但可能改变MicroRNA结合，导致基因转录活性发生变化，因此具有一定的研究价值。

图3 中国荷斯坦牛CSN3基因突变区域基因型突变序列比对Fig.3 Sequencing comparison between different genotypes of mutational regions of CSN3 gene in Chinese Holstein cattle

本研究分析了这4个SNPs位点的基因型频率、等位基因频率、杂合度、有效等位基因数和多态信息含量等遗传指标，并进行卡方检验检测Hardy-Weinberg平衡状态，结果见表2和表3。表2显示，CSN3基因g.463A>G处，GG为优势基因型；g.1012A>C处，CC是优势基因型；g.2015T>A处，AA为优势基因型；g.2396A>T处，TT为优势基因型。表3显示，g.463A>G和g.2015T>A位点处于Hardy-Weinberg平衡状态(HWE<5.991)；4个SNPs位点均处于中度多态(0.25

表2 中国荷斯坦牛CSN3基因4个SNP位点的基因型频率和等位基因频率Table 2 Genotypes and allele frequencies among four SNP loci in CSN3 gene of Chinese Holstein cattle

表3 中国荷斯坦牛CSN3基因4个SNP位点的遗传参数Table 3 Genetic parameters among four SNP loci in CSN3 gene of Chinese Holstein cattle

2.3 CSN3基因SNP位点的不同基因型对中国荷斯坦牛泌乳性状的影响

将565头荷斯坦母牛的3个泌乳性状分别与CSN3基因突变位点的基因型进行关联分析,结果(表4)显示，g.463A>G位点上的GG基因型泌乳性状表现最优，乳脂率极显著高于AA基因型(P<0.01)，乳蛋白率显著高于AA基因型(P<0.05)；g.1012A>C位点上的AA基因型为优良基因型，其乳脂率极显著高于CC基因型(P<0.01)；g.2015T>A位点不同基因型在乳脂率和乳蛋白率方面差异显著(P<0.01)，TT基因型极显著高于AT和AA基因型。g.2396A>T位点3种基因型各泌乳性状指标无显著差异。

表4 中国荷斯坦牛CSN3基因的基因型与泌乳性状的关联性分析Table 4 Association of CSN3 gene polymorphisms with milk production traits of Chinese Holstein cattle

注：同一位点同列数据后标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

Note:Different lowercase letters in each column indicate significant difference (P<0.05) and different uppercase letters mean extremely significant difference (P<0.01).

2.4 CSN3基因SNP位点的单倍型和连锁不平衡分析

对CSN3基因上4个SNPs位点进行单倍型分析，总共检测到16种单倍型，分别为Hap1～Hap16(表5)，其中单倍型Hap13的发生频率最高，达到0.327，其次为单倍型Hap14和单倍型Hap9，发生频率分别为0.161和0.083。由于发生频率低于0.050的单倍型在统计学分析中没有意义，故只保留Hap5、Hap7、Hap9、Hap13、Hap14和Hap15等6种用于双倍型的关联性分析。

连锁不平衡分析结果(表6)表明，4个SNPs位点两两间的r2值均小于0.330。r2值大于0.330，表明2个位点间具有较强的连锁不平衡，因此本研究发现的4个SNPs位点间不存在强连锁性。

表5 中国荷斯坦牛CSN3基因4个SNPs位点的单倍型频率分析Table 5 Haplotypic frequencies among four SNPs loci in CSN3 gene of Chinese Holstein cattle

表6 中国荷斯坦牛CSN3基因4个SNPs位点的连锁不平衡分析Table 6 Estimated LD values of four SNPs loci in CSN3 gene of Chinese Holstein cattle

2.5 CSN3基因SNP位点双倍型对中国荷斯坦牛泌乳性状的影响

经分析得出，CSN3基因4个SNPs位点共有15种双倍型，将其中发生频率高于5.00%的双倍型与中国荷斯坦牛泌乳性状进行关联性分析，结果如表7所示。由表7可以看出，双倍型H14H14个体的乳脂率极显著高于双倍型H13H14(P<0.01)，并且显著高于双倍型H5H15、H9H13和H13H13(P<0.05)。因此，在本试验群体中，双倍型H14H14是最优秀的双倍型。

表7 中国荷斯坦牛CSN3基因双倍型与泌乳性状的关联性分析Table 7 Diplotypes of CSN3 gene associated with milk production traits of Chinese Holstein cattle

注：同列数据后标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

Note:Different lowercase letters in each column indicate significant difference (P<0.05) and different uppercase letters mean extremely significant difference (P<0.01).

3 讨 论

CSN3基因编码的κ酪蛋白是哺乳动物乳蛋白的主要成分之一，其除起到营养作用外，还有一个重要的功能就是稳定蛋白质，防止牛奶蛋白质凝聚和沉淀[9]，在自然状态下，使牛奶保持稳定的乳浊液状态[10]。酪蛋白参与调控酪蛋白微团的稳定性，影响乳微粒的大小，进而对乳品质具有重要的调控作用[11]。酪蛋白含有动物体几乎全部的必需氨基酸，是营养价值很高的蛋白质，并且能提高幼仔对钙、磷等的吸收能力[12]。基于此，CSN3基因可被视为对哺乳动物泌乳性能具有重要作用的候选基因。李玲等[13]发现，在3组泌乳性能不同的西农萨能奶山羊中，CSN3基因在乳腺中的表达量对乳蛋白和产奶量具有显著影响。赵春江等[14]通过酶切分型法分析了187头中国荷斯坦牛CSN3基因的多态性，发现CSN3的突变位点与乳蛋白率显著相关。Alim等[15]通过飞行质谱法，在荷斯坦牛CSN3基因中检测到6个SNP位点，这6个SNP位点均对产奶量、乳脂率和乳蛋白率有影响。本研究发现了4个SNP位点，这些位点与Alim所检测到的SNP位点不一致，导致这一结果的原因可能是样本选择以及样本量不相同造成的。Alim采集样本的地点在山东，样本数量为398头，而本试验的采样地点在陕西，样本数量为565头。分析表明，本试验检测出的CSN3基因的SNP位点与中国荷斯坦牛泌乳性状紧密关联。Caravaca等[16]就CSN3基因的多态性与产奶量、乳脂率、乳蛋白率、乳糖率的关联性进行了研究，证实CSN3基因BB型具有较高的产奶量和乳蛋白率。在捷克弗莱维赫牛中，Matějicek等[17]通过组合CSN3和LGB基因的SNP位点发现，组合基因型ABAA与泌乳性能紧密关联。Moioli等[18]在绵羊和山羊奶品质的研究中对CSN3的多态性进行检测，发现CSN3基因对乳蛋白含量有显著影响。Alipanah等[19]在俄罗斯牛种中发现，BB型个体比AA型和AB型有更高的乳蛋白率。有人通过筛选候选基因的方法，对CSN3基因外显子启动子区进行研究，发现了多个与产奶性状显著相关的SNP位点[20-21]。奶牛的乳脂率一般为3.5%左右，而本研究的乳脂率都在4%以上，平均值为4.345%。这是由于牛奶中乳脂率受到诸多因素影响，包括奶牛品种、营养摄入、管理水平及泌乳阶段等。本试验采样过程中，所涉及到的奶牛基本处于产后的第4～8周，这一阶段由于能量供给不足导致奶牛处于能量负平衡状态，奶牛会动用脂肪组织来供给能量，从而导致乳脂率较高。本试验在中国荷斯坦牛CSN3基因上检测到4个SNP位点，除g.2396A>T位点外，其余3个SNP位点与泌乳性状紧密关联,具体而言，g.463A>G和g.2015T>A均可以显著影响乳脂率和乳蛋白率，g.1012A>C可以显著影响乳脂率。双倍型关联性分析发现，H14H14乳脂率显著高于其余双倍型。综上，CSN3基因可以作为候选基因应用于中国荷斯坦牛泌乳性状的选育工作中。

目前，越来越多的研究指出，3′UTR区域上的突变位点可以通过改变mRNA的稳定性，进而影响到蛋白的表达和表型[22]。在中国荷斯坦牛上，FADS2基因3′UTR区域上的c.1571A>G和c.2776A>G能够显著影响牛乳脂肪酸组成[23]；在秦川牛上，SIRT2基因的3′UTR区域的g.19676G>A突变与背膘厚显著关联[24]；在南阳牛上，LHX4基因3′UTR区域的g.463A>G位点与牛的生长发育密切关联[25]。本试验在中国荷斯坦牛CSN3基因外显子和3′UTR区域共检测到4个SNP位点(g.463A>G，g.1012A>C，g.2015T>A和g.2396A>T)，除g.463A>G外，其余3个SNP位点均定位于3′UTR区域，且不改变氨基酸结构，但关联性分析发现，g.1012A>C和g.2015T>A与中国荷斯坦牛泌乳性状密切关联。本试验中，g.1012A>C和g.2015T>A 2个SNP位点影响中国荷斯坦牛泌乳性状的具体作用机制还有待进一步研究。

4 结 论

本研究发现，CSN3基因在中国荷斯坦牛中存在多态性，其中g.463A>G、g.1012A>C和g.2015T>A与泌乳性状紧密关联，优势双倍型为H14H14，其个体的乳脂率显著或极显著高于其他双倍型，可以尝试将CSN3基因作为影响泌乳性状的候选基因用于标记辅助选择。

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