ε-聚赖氨酸生产菌的硫酸二乙酯诱变及其 发酵培养基优化

李聪，扶教龙*，施磊，吴晨奇，扶明明，胡翠英

(1.苏州科技大学 化学生物与材料工程学院，江苏 苏州 215009；2.苏州农业职业技术学院 食品科技学院，江苏 苏州 215008；3.赣州农业学校，江西 赣州 341100)

ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine，ε-PL)最早由日本学者Shima S和Sakai H发现并命名，他们在试图寻找一种分泌生物碱的微生物时，意外地从白色链霉菌(Streptomycesalbulus)的发酵液中发现了这种生物碱的类似物[1]。

ε-聚赖氨酸是一种赖氨酸的同聚物，与一般氨基酸聚合物不同，它是由α-氨基和ε-羧基的作用将L-赖氨酸残基连接起来的聚合物，其聚合度一般为25～35[2]。其具有非常广泛的抑菌谱和优异的抑菌效果，对革兰氏阳性、阴性细菌、霉菌和真菌等微生物的生长均有出色的抑制效果[3]。同时，又因为其具有热稳定性好、易溶于水、酸碱耐受性强及难以被人体吸收(安全性好)等特点，所以ε-PL被广泛地应用于食品领域，作为一种绿色健康的食品防腐剂。继日、美、韩等国家后，我国也于2014年将其批准用作食品添加剂[4]，ε-PL应用的发展方兴未艾。

工业的生产得益于产量的提高，野生的ε-PL生产菌产量低下，因此对其进行育种改造至关重要。物理、化学诱变是最传统同时也是最为行之有效的育种途径；余明洁、杨玉红等[5，6]对出发菌进行了紫外诱变，ε-PL产量都有显著提高；贾士儒、陈玮玮等[7，8]用化学诱变的方法处理了白色链霉菌的孢子并取得了不错的效果。除了培育出更高产的菌种，对其培养基的优化能改善生产菌的生长情况与代谢途径，从而进一步提高ε-PL的产量。Shih和Shen[9]对培养基中的主要营养组分(酵母粉、葡萄糖和硫酸铵)进行了优化，最终产量与原始配方相比提高了98.4%。其中江南大学利用诱变菌株Streptomycessp. M-Z18经补料发酵，并在发酵液中加入滑石粉结合pH冲击技术，ε-PL产量达到了62.36 g/L，是现阶段报道的最高水平[10]。

本实验对出发菌白色链霉菌FQ-23进行Gly，SG，L-Lys三重抗性筛选，通过DES诱变后，筛选得到高产突变菌。然后筛选出更为适合的有机氮源并利用响应面法对原始培养基中的成分进行了优化，获得了更高的ε-PL产量。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验菌株

白色链霉菌(Streptomycesalbulus)FQ-23。

1.1.2 仪器设备

KU-T3紫外-可见光分光光度计 上海精密仪表有限公司；SW-CJ-1FD/2FD型超净工作台 苏州尚田洁净技术有限公司；DKY-Ⅱ型恒温调速回旋式摇床 上海社科自动化有限公司；HT-250B电热恒温培养箱 上海赫田科学仪器有限公司；SPX-250BSH-Ⅱ型生化培养箱 新苗医疗器械制造有限公司。

1.1.3 培养基

1.1.3.1 斜面/平板培养基

葡萄糖10 g/L，琼脂15 g/L，酵母粉1 g/L，蛋白胨2 g/L，pH 7.0～7.5，1×105Pa灭菌15 min。

1.1.3.2 三重抗性平板

在斜面/平板培养基的基础上添加Gly 5.95 g/L，SG 4.80 g/L，L-Lys 1.35 g/L，pH 7.0～7.5，1×105Pa灭菌15 min。

1.1.3.3 种子/摇瓶发酵培养基

葡萄糖50 g/L，酵母粉5 g/L，(NH4)2SO410 g/L，磷酸二氢钾1.36 g/L，硫酸镁0.5 g/L，磷酸氢二钾0.8 g/L，硫酸亚铁0.03 g/L，硫酸锌0.04 g/L，pH 6.8，1×105Pa灭菌15 min。

1.2 实验方法

1.2.1 诱变方法

1.2.1.1 单孢子悬液的制备

将灭菌后的生理盐水注入斜面，用无菌竹签将孢子轻轻刮下，充分搅拌制成孢子悬液，最后经8层无菌纱布过滤，制成单孢子悬液。

1.2.1.2 诱变时间的选择

取1 mL单孢子悬液稀释10倍，用pH为7.0的磷酸缓冲液稀释7次(每次稀释10倍)，将最低浓度的孢子悬液分别吸取5 mL至7个小摇瓶中，后将5 mL浓度为2%的DES分别加入小摇瓶中，即DES的含量仅为1%，将7个小三角瓶于恒温振荡器中振荡0～60 min，每隔10 min取出1瓶，在取出的摇瓶内加入1 mL硫代硫酸钠作为诱变终止剂，充分振荡后保证混匀，孢子浓度稀释至108左右后将其涂布于平板之上，设3组平行，30 ℃恒温培养一段时间，分析诱变时间对死亡率的影响。

1.2.1.3 初筛

将经过诱变后的菌株置于平板上，并在30 ℃恒温的环境下培养，挑取长势良好的单菌落，扩培至斜面培养基用于下面的复筛工作。

1.2.1.4 复筛

从初筛菌株的斜面中各挑取2环孢子分别接入发酵摇瓶中，经过3天发酵，测出ε-PL产量。

1.2.1.5 传代稳定性实验

将复筛中得到的高产菌株于斜面进行连续传代培养，并对各代菌株进行摇瓶发酵，测定ε-PL产量，考察高产菌株是否具备稳定的高产量。

1.2.2 测量方式

1.2.2.1 测定的含量

出于实验目的的考虑，本文选择文献[11]法测定ε-PL的含量。标准曲线参考吴晨奇等[12]的方法。

1.2.2.2 菌体干重(DWC)的测定

取9 mL发酵液至离心管中，4000 r/min离心10 min，保留沉淀；将该沉淀用去离子水洗涤2次后置于烘箱烘干至恒重。

1.2.3 培养基优化

1.2.3.1 单因素实验

通过对酵母粉、玉米浆、牛肉膏、鱼粉、生物素和蛋白胨这6种有机氮源的筛选，挑选出2种最佳的有机氮源，并对培养基中葡萄糖、硫酸铵和2种有机氮源进行单因素实验，找出这4种关键成分的最适浓度。各实验因子浓度梯度设计见表1。

1.2.3.2 CCD中心组合实验设计

中心组合实验(central composite design，CCD)是以2水平全因子和分部实验为基础，发展出来的1种实验设计方法。它通过对2水平的实验添加1个设计点，评估出输出变量和各因素间的关系，并将这种非线性关系拟合生成响应面。

在单因素实验结果的基础上，以上述培养基最优浓度为基础，利用对不同因素进行分析，并按表2进行实验设计。

表2 CCD实验设计Table 2 Design of central composite design g/L

2 结果与分析

2.1 DES诱变时间的确定

DES是一种常见的烷化剂，它通过参与和若干碱基的反应过程，致使DNA的复制过程紊乱，其碱基对间的配对出现错误，最终导致菌株死亡或变异。因此，其能够强烈地促成微生物细胞的变异。在低浓度DES溶液(1%)的作用下，做出致死率与诱变时间之间的关系图，通过致死率曲线来找出致死率在80%～85%左右的最佳诱变时间，其致死率曲线见图1。

图1 白色链霉菌DES诱变致死率曲线Fig.1 The DES fatality rate curve of Streptomyces albulus

由图1可知，在诱变30 min时，该菌株的致死率约为82%，因此设置30 min为实验的最优时间。

2.2 突变菌株抗性筛选

孢子悬液经过30 min的诱变后，被涂布于抗性平板之上。设置3组抗性平板，第1组和第2组分别为加入了较低和较高浓度的Gly，L-Lys和SG的平板；第3组不添加抗性。

挑取平板中长势最好的单菌落，转接入斜面保藏。本实验共挑取了40株长势良好的单菌落，其中1～10号菌挑选自第1组平板，11～20号菌挑选自第2组平板，21～40号菌挑选自第3组平板。将这40株菌分别进行72 h左右的摇瓶发酵培养，测定各自的ε-PL产量。诱变实验结果见图2，出发菌产量见图中虚线所示，为0.896 g/L。

图2 DES诱变筛选结果Fig.2 Results of DES mutagenesis screening

由图2可知，在总共40株菌中，产量高于出发菌株的有10株，其正突变率为25%，其中1～10号菌株(低浓度3种抗性组别)中有8株产量高于出发菌株，正突变率高达80%。其中，3，4，6，7，16，25号这6株菌的ε-PL产量较出发菌有明显的提高，3号菌株的产量为1.042 g/L，4号菌株的产量为1.167 g/L，6号菌株的产量为1.219 g/L，7号菌株的产量为1.104 g/L，16号菌株的产量为1.062 g/L，25号菌株的产量为1.090 g/L。

2.3 突变菌株传代稳定性考察

对上述产量较高的6株菌进行遗传稳定性实验，在培养了6代之后发现3号菌株可稳定遗传，并将其命名为白色链霉菌FQF-3。

图3 菌株FQF-3的传代稳定性实验结果Fig.3 The experimental results of genetic stability of strain FQF-3

由图3可知，白色链霉菌FQF-3的产量较为稳定，2～6代菌的产量均高于出发菌，可用于今后进一步的研究。

2.4 培养基优化

2.4.1 不同有机氮源对ε-聚赖氨酸的影响

有机氮源对微生物生长至关重要，只有合理地在培养基中加入有机氮源，菌体的生长和产物的代谢才能正常进行[13]。本部分实验旨在探究不同有机氮源对菌体生长和ε-PL合成的影响，见图4。

图4 不同有机氮源对ε-PL产量的影响Fig.4 Effect of different organic nitrogen sources on ε-PL production

当有机氮源为鱼粉时，ε-PL产量最高，为1.11±0.03 g/L，显著高于酵母粉等其余有机氮源。此外，当把玉米浆作为培养基中唯一的有机氮源时，白色链霉菌的菌体浓度显著高于其他实验组。鉴于发酵生产时，ε-PL产量与菌体量相偶联，越高的菌体量通常代表着越高的产量。因此，我们将鱼粉和玉米浆复配进行后续研究，以期获得更高的ε-PL产量。

2.4.2 通过实验确定碳氮源浓度

无可否认，氮源是微生物繁殖过程中不可或缺的成分，在上述实验中选择了鱼粉和玉米浆作为混合有机氮源后，本部分实验将混合有机氮源、葡萄糖和硫酸铵进行单因素实验，以探究不同浓度的相应组分对产量的影响，单因素实验结果见表3。

表3 单因素实验结果Table 3 Results of single-factor experiment

由表3可知，葡萄糖、硫酸铵、玉米浆、鱼粉的最适浓度分别为50,10,8,12 g/L，ε-PL的产量分别为0.97±0.03，0.95±0.05，0.85±0.03，0.98±0.04 g/L。

2.4.3 响应面法优化发酵培养基

2.4.3.1 建立模型，检验实验结果

探讨不同因素对菌株培养效果的影响后，利用Design-Expert，设计成四因素五水平的实验，以求对上述4大成分进一步优化，实验方案及其结果见表4。

表4 CCD实验结果Table 4 The experimental results of central composite design g/L

将表4中各参数的数据进行对比分析，通过软件进行拟合从而建立以下方程，表达不同因素对ε-PL产量(Y)的影响，A，B，C，D分别代表葡萄糖、硫酸铵、玉米浆和鱼粉：Y=1.370-0.066A-0.004B-0.010C+0.027D-0.006AB+0.005AC-0.004AD+0.010BC+0.009BD-0.007CD-0.083A2-0.087B2-0.081C2-0.110D2。

对结果进行显著性检验和方差分析，结果见表5。

表5 响应面实验回归系数检验表Table 5 ANOVE analysis for regression equation

续 表

由表5可知，该模型总体的P值(P-Value)<0.0001，表明总体来说，该模型偶然误差很小，有较好的拟合度且高度显著；其中，失拟项(Lack of Fit)仅为0.1131，可见该模型的失拟项较小，失拟并不显著，模型较为可靠；经过计算可知，方程系数接近1，拟合度较好，由此可见，我国能够直接通过这一方程直观地表现出ε-PL产量与4个自变量之间的关系，从而预测出较为准确的结果。

2.4.3.2 优化响应面

为探讨不同因素之间的影响以及与菌株产量之间的关系，本文设计了单因素实验，并且得到了不同的响应面图，见图5～图10。

图5 葡萄糖和(NH4)2SO4的响应面结果Fig.5 Response surface plot for glucose and (NH4)2SO4

图6 玉米浆和葡萄糖的响应面结果Fig.6 Response surface plot for corn pulp and glucose

图7 葡萄糖和鱼粉的响应面结果Fig.7 Response surface plot for glucose and fish meal

图8 (NH4)2SO4和玉米浆的响应面结果

图9 (NH4)2SO4和鱼粉的响应面结果Fig.9 Response surface plot for (NH4)2SO4 and fish meal

图10 玉米浆和鱼粉的响应面结果Fig.10 Response surface plot for corn pulp and fish meal

由图5～图10可知，各因素过高或过低均会影响ε-PL的发酵水平，当保持其中一成分不变时，ε-PL的产量会先随着另一成分的增加而增加，但当该成分超过一定值时，ε-PL的产量则会相应降低，反之亦然。以图5为例子，如果葡萄糖的浓度始终保持不变，那么当硫酸铵的浓度不断提高时，可发现菌株的产量也有所提高。换言之，两者呈正相关关系，直到硫酸铵浓度超过10 g/L，ε-PL的产量开始随硫酸铵浓度的提高而下降。当保持硫酸铵浓度不变时，ε-PL产量与葡萄糖浓度的关系大致相同，也是先提高后降低。

在上述实验结果的基础之上，通过软件对各参数的分析，得到了预估的最佳成分，见表6。

表6 培养基预测结果表Table 6 The prediction results of medium composition g/L

表6中所示成分加上M3G培养基中剩余成分即为最佳培养基，在该培养基下，预估所得ε-PL产量达到了1.373 g/L，比出发菌株提高了53.2%。

2.4.3.3 优化培养基的验证

按上述的配方往培养基中加入各物料，随后等待菌株发酵，在此过程中将摇瓶放入摇床并设置摇床条件为：30 ℃，200 r/min，经过72 h的培养，测出发酵液中ε-PL的含量。进行3次同样的实验，数据分别为1.368,1.374,1.371 g/L。

该实验结果与预测值基本保持一致。换言之，本次实验数据具有研究意义，所建立的模型准确性较高。

3 结论与展望

本实验以在StreptomycesalbulusFQ-23的基础上，利用DES诱变的方式，得到了1株稳定遗传的高产菌株FQF-3，经6代连续培养产量稳定在0.976 g/L，与出发菌株相比提高了8.93%；经过筛选，将鱼粉与玉米浆作为发酵产ε-PL的混合有机氮源；通过单因素结合响应面的方法对其培养基进行优化，可知培养基最合适的组合是(g/L):葡萄糖49.70，(NH4)2SO49.95，玉米浆7.79，鱼粉12.52，磷酸二氢钾1.36，硫酸镁0.5，磷酸氢二钾0.8，硫酸亚铁0.03，硫酸锌0.04，此时，ε-PL的预测产量为1.373 g/L，是出发菌株产量的1.53倍；经过3次重复实验的验证，得到ε-PL产量的平均值为1.371 g/L，与预测值非常接近，表明此模型具有可行性。

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