MMP-9和紧密连接蛋白Occludin在慢性阻塞性肺疾病大鼠肺部的表达

张子洲

(常州市第七人民医院呼吸病科，江苏 常州 213011)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是由肺的弹性减小、气道和肺泡结构改变所引起的空气滞留和肺部充气过度，具有持续存在的气流受限特征〔1，2〕。COPD发病机制主要是气道内慢性炎症、蛋白酶/抗蛋白酶失衡等〔2，3〕，最终引起肺组织结构破坏，肺功能下降。研究表明基质金属蛋白酶(MMP)-9通过调节细胞外基质(ECM)的降解与生成，参与机体内气道重构和血管重塑〔4，5〕。肺上皮细胞和肺毛细血管内皮细胞间的紧密连接(TJ)在维持肺泡的上皮机械屏障和通透性发挥关键作用〔6〕。Occludin蛋白是被首次发现组成TJ结构蛋白，其C、N末端与闭锁小带蛋白(ZO-1、ZO-2和ZO-3)连接并相互作用，是保持肺泡结构稳定和通透性的关键部分〔7〕。本实验研究MMP-9和TJ蛋白Occludin在COPD大鼠肺部的表达。

1 资料与方法

1.1一般资料 Wistar大鼠30只(昆明实验动物中心)，雌雄各半，体重(180±20)g，鼠龄10 w。试剂：脂多糖、内毒素1 mg/ml(美国Sigma公司)；哈德门牌过滤嘴香烟(山东中烟工业)；一抗：多克隆兔抗Occludin抗体(美国Sigma公司)；二抗：山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(北京中杉金桥生物技术有限公司)；兔抗人多克隆MMP-9抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)；MMP-9酶联免疫分析试剂盒、免疫组化染色(SABC)法试剂盒(北京中山生物技术有限公司)；OLYMPUS CX22显微镜(日本奥林巴斯公司)；HMIAS-2000H病理图文分析系统，北京鼎永华泰科技有限公司。

1.2动物模型的制备 大鼠随机分为COPD组和对照组各15只。两组均使用同种方式饲养，对照组给予正常空气，COPD组置于烟箱内，被动吸烟(3次/d，30 min/次，第1天每次5支，第2、3天每次10支，以后每次15支)完成COPD模型的建立。所有操作均在无菌条件下进行，两组大鼠均饲养造模14 w后处死。

1.3标本采集 造模结束后，使用4%的水合氯醛腹腔注射将大鼠麻痹，打开胸腔，夹闭右主支气管，在气管下横行切口处置入硅胶管，缓慢注射生理盐水灌洗左肺，重复3次，回收灌洗液，过滤、4℃离心、上清液冻存-70℃冰箱中，用于MMP-9的测定。灌洗后剖开腹腔，下腔静脉采血5 ml、4℃离心、分离出的血清-70℃冻存，用于MMP-9测定。取大鼠左肺组织浸泡固定于4%的多聚甲醛溶液中，常规包埋、切片，苏木精-伊红(HE)染色，用于病理形态学分析。

1.4MMP-9的测定 支气管肺泡灌洗液(BALF)和血清中MMP-9的测定采用酶联免疫吸附法(ELISA)，操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.5Occludin的测定 肺组织蜡块切成4 μm切片后采用SABC法进行染色，操作严格按照试剂盒说明书进行作。以0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)作为阴性对照，置于光镜下观察。SABC染色结果通过图像分析，测出Occludin表达的平均灰度。

1.6统计学方法 应用SPSS19.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1肺组织形态学观察 对照组双肺结构正常、无明显病理变化、无明显出血点、弹性较好、表面光滑，肺泡结构完整、清晰、大小均匀。COPD组肺泡明显肿大、颜色灰白，肺泡间隔水肿增宽，肺泡壁断裂，肺泡结构异常，出血严重。见图1。

图1 各组肺组织形态(HE)

2.2两组血清及BALF MMP-9水平比较 COPD组血清及BALF MMP-9水平〔(490.21±25.97)μg/L、(495.52±9.45)μg/L)〕均显著高于对照组血清中MMP-9水平〔(381.93±19.35)μg/L，P<0.05〕；COPD组BALF与COPD组血清中MMP-9水平差异无统计学意义(P>0.05)；COPD组BALF MMP-9水平显著高于对照组BALF中MMP-9水平〔(399.29±20.03)μg/L,P<0.05〕。

2.3Occludin在肺组织中的表达 Occludin在对照组大鼠肺泡上皮细胞表达较多，呈棕褐色；Occludin在COPD组大鼠肺泡上皮细胞表达较少，并且COPD组表达的平均灰度(96.68±11.86)明显少于对照组〔(121.87±13.55),t=5.848，P=0.000〕。见图2。

图2 各组肺组织Occludin表达(SABC法，×100)

3 讨 论

COPD是由于气流阻塞导致的慢性气道疾病，严重吸烟者的发病率较高。目前认为MMPs是COPD患者肺部ECM降解最重要的酶类〔8〕。目前认为MMP-9是MMPs中最重要的酶类之一，且与吸烟关系密切，MMP-9能分解气道和肺组织的ECM和基底膜，参与气道和肺组织的重塑〔9〕。MMP-9在COPD患者中表达水平上调较为显著，加之其表达细胞众多，作用底物广泛，近年来备受关注，成为国内外内研究的焦点之一。本研究表明COPD组的大鼠通过大量吸烟导致肺部产生慢性炎症，使MMP-9表达过多，使ECM的降解产物增多，造成堆积，最终导致气道组织受到破坏和肺气肿，与钟晓芃等〔10〕研究结果一致。Russell等〔11〕研究表明MMP-9过度表达在肺气肿的形成过程中起重要作用，MMP-9通过破坏肺泡基质成分，介导炎症细胞聚集导致气流阻塞等参与COPD发病过程。

肺泡上皮细胞与内皮细胞之间的TJ，是保证肺泡结构和功能稳定的主要组成部分。在维持肺泡结构稳定和通透性上TJ蛋白发挥着至关重要的作用。TJ蛋白可以隔离溶液中的分子渗入体内，保持体内环境相对稳定，维持细胞的极性。Occludin是紧密蛋白中的跨膜整合蛋白，保持正常的肺泡上皮屏障的主要组成部分〔12，13〕。Occludin蛋白的表达数量及蛋白活性发生改变，会影响肺泡上皮细胞与内皮细胞之间的TJ，导致肺部细胞的通透性增加，间隙扩大，一些外部物质容易进入肺部引起肺部的炎症感染。本研究发现，COPD组大鼠肺泡上皮细胞的保护功能改变可能与Occludin的数量及活性变化具有一定的关系。COPD组TJ Occludin数量明显减少，从而使肺泡上皮细胞与内皮细胞之间的TJ受到破坏，从而导致肺泡膜的完整性、通透性受到影响，最终引起肺部损伤及水肿，与Lee等〔14〕发现Occludin和ZO-1的在血管内皮细胞中的表达和分布与其通透性密切相关的表述基本一致。

综上，MMP-9参与了COPD的发病过程，MMP-9在COPD大鼠模型中明显增加。COPD大鼠肺泡上皮屏障功能与Occludin蛋白表达的数量及改变的一系列变化有关。可以通过改变肺泡中MMP-9和Occludin蛋白的表达，阻止COPD病情进一步发展。

1张继如，董 楠，钱红娣，等.右美托咪定改善合并中度慢性阻塞性肺疾病肺癌手术患者的肺氧合功能〔J〕.中南大学学报：医学版，2017；42(3)：271-6.

2句红萍，汪玉娇，张 伟，等.紧密连接蛋白Occludin与ZO-1在COPD大鼠肺部的表达〔J〕.昆明医科大学学报，2012；33(6)：43-7.

3刘恩顺，刘 伟，孙增涛，等.清肺消炎丸对COPD大鼠肺组织MMP-9和TIMP-1表达的影响〔J〕.世界中医药，2013；8(6)：649-51.

4李世敏，梁虹芳，孔英君.CCL20和MMP-9在COPD大鼠中的表达及多西环素对其表达的影响〔J〕.哈尔滨医科大学学报，2016；50(4)：279-83.

5童卫泉，杨宏宽，夏婷婷，等.保肺定喘汤对COPD气道重塑大鼠MMP-9、VEGF水平的影响〔J〕.江西中医药大学学报，2016；28(6)：67-70.

6曹惠鹃，孙莹杰，张铁铮，等.体外循环对大鼠肺组织紧密连接蛋白occludin表达的影响〔J〕.中华麻醉学杂志，2012；32(9)：1072-4.

7李承峰，焦光宇，刘春利.紧密连接蛋白在脂多糖致急性肺损伤大鼠肺组织的表达〔J〕.中国现代医生，2011；49(15)：16-7.

8陈远骥，王伯章.基质金属蛋白酶-9与慢性阻塞性肺疾病的研究〔J〕.医学综述，2006；12(11)：648-51.

9吕 磊，王成阳，刘向国，等.六味补气胶囊对肺气虚型慢性阻塞性肺疾病大鼠气道重塑中病理形态和MMP-9、MMP-12表达的影响〔J〕.中国老年学杂志，2013；33(24)：6181-4.

10钟晓芃，朱宝玉.基质金属蛋白酶及组织型金属蛋白酶抑制物与慢性阻塞性肺疾病的关系〔J〕.国际呼吸杂志，2005；25(6)：455-7.

11Russell RE，Culpitt SV，Dematos C，etal.Release and activity of matrix metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 by alveolar macrophages from patients with chronic obstructive pulmonary disease.〔J〕.Am J Respir Cell Mol Biol，2002；26(26)：602-9.

12Bouvry D，Planès C，Malbertcolas L，etal.Hypoxia-induced cytoskeleton disruption in alveolar epithelial cells〔J〕.Am J Res Cell Mol Biol，2006；35(5)：519.

13Van DW，Kreindler JL，Malik AB，etal.Interrelations/cross talk between transcellular transport function and paracellular tight junctional properties in lung epithelial and endothelial barriers〔J〕.Am J Physol Lung Cell Mol Physiol，2007；293(3)：L520.

14Lee HS，Namkoong K，Kim DH，etal.Hydrogen peroxide-induced alterations of tight junction proteins in bovine brain microvascular endothelial cells〔J〕.Microvasc Res，2004；68(3)：231.