活血化瘀中药对人永生化角质形成细胞株活血的影响及作用机制

王 生 张 晶 康 康 刘 洋

(唐山市工人医院皮肤科，河北 唐山 063000)

老年人因激素分泌减少，皮肤腺功能减退和退行性萎缩，屏障功能丧失，易引发多种慢性皮肤病，银屑病是其中常见的一种〔1〕。目前，银屑病的发病机制仍未明确，临床疗效不够理想，探寻安全有效的治疗方案具有重要意义。有报道显示，活血化瘀疗法对瘀阻肤络型的银屑病有较好的疗效〔2〕。本实验通过肿瘤坏死因子(TNF)-α诱导人永生化角质形成细胞株Ha-cat在体外模拟银屑病表皮角质细胞的过快增殖，观察活血化瘀复方提取物对细胞增殖、凋亡的影响，并进一步分析细胞中Bcl-2、Bax mRNA和蛋白表达水平，初步探讨其治疗银屑病的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 Ha-cat细胞株购于上海慧颖生物科技有限公司；活血化瘀复方：核桃、红花、丹皮、丹参、玄参等组成，由本院药剂科提供；细胞增殖与毒性检测试剂盒购于上海普飞生物技术有限公司；FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒购于上海博谷生物科技有限公司；Bcl-2、Bax抗体购于美国CST中国分公司。

1.2方法

1.2.1活血化瘀复方制备 取活血化瘀复方中的药材用清水煎煮3次，收集滤液，减压浓缩后真空干燥，得到药粉，冷藏保存待用。实验前取药粉1 g(相当于原生药2.95 g)，用DMEM细胞培养液分别稀释至20、25、30 g/L，调节pH7.0后使用。

1.2.2细胞培养与分组 用含胎牛血清的DMEM培养基在37℃ 5%CO2培养箱中孵育Ha-cat细胞。取对数生长期细胞，调整浓度为1×109/L，每孔1×106个细胞接种于6孔板中，培养至80%～90%融合，用50 μg/L TNF-α诱导24 h为模型组，模拟银屑病表皮角质细胞的过快增殖；再分别以浓度20、25、30 g/L的活血化瘀复方水提物作用造模后的细胞24 h为活血化瘀复方组；以全程仅加DMEM完全培养基的Ha-cat细胞为空白对照组。

1.2.3细胞增殖和凋亡情况检测 制备Ha-cat细胞悬液，调整密度为1×106/L，接种于96孔板中，分组同1.2.2，达到作用时间。①CCK8法检测细胞增殖情况，向培养孔中滴加细胞增殖与毒性检测试剂，37℃ 5%CO2培养2 h，上酶标仪读取450 nm处吸光度值，计算生长抑制率和IC50。②流式细胞术检测细胞凋亡情况，0.25%胰酶消化相应培养孔中的细胞，3 000 r/min离心收集细胞，调整细胞浓度后按试剂盒说明进行染色，使用流式细胞仪检测。

1.2.4Western印迹检测细胞中Bcl-2、Bax蛋白表达 RIPA抽提Ha-cat细胞蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度，调整浓度至5 g/L，加入缓冲液后95℃静置10 min。配置分离胶和浓缩胶，待测蛋白样品电泳，湿法转移目标蛋白至聚偏氟乙类(PVDF)膜，脱脂奶粉封闭40 min，滴加Bcl-2抗体、Bax抗体，均为1∶1 000稀释，内参为β-actin抗体(1∶500稀释)，4℃孵育过夜，次日滴加HRP标记二抗，室温静置90 min，洗膜，ECL显色，检测各特异性条带灰度值。

1.2.5RT-PCR检测Bcl-2、Bax mRNA表达 Trizol提取Ha-cat细胞总RNA，反转录为cDNA。Bcl-2上游引物：5′-CACCCCATCCCGACTGATCT-3′，下游引物：5′-TCTCTCCCTCCGGACTTCTC-3′，片段长度144 bp；Bax上游引物：5′-GTACCCGACCTGTAACCTGA-3′，下游引物：5′-TTTCATCCTCTCCTCCGGCA-3′，片段长度148 bp；内参β-actin上游引物：5′-ACTGCACCTGTAGGCGTTTC-3′，下游引物：5′-CACCTTCCACCTGTCGC TCC-3′，片段长度198 bp。扩增条件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40个循环，延伸72℃ 5 s，55℃ 20 s。2-△△Ct法对Bcl-2、Bax基因行相对定量分析。

1.3统计学分析 采用SPSS22.0软件行t检验。

2 结 果

2.1活血化瘀复方对TNF-α诱导的Ha-cat细胞形态学影响 空白对照组Ha-cat细胞生长状态良好，仅少量细胞悬浮于培养液中；模型组细胞形态完整且生长迅速，已铺满近90%；活血化瘀复方组细胞数量较模型组明显下降，细胞体积缩小、间隙增大、碎片增多，细胞间连接减少或消失，但20 g/L剂量组改变程度较25、30 g/L剂量组轻微。见图1。

2.2活血化瘀复方对TNF-α诱导的Ha-cat细胞增殖和凋亡的影响 活血化瘀复方各剂量组对Ha-cat细胞增殖抑制率均明显高于空白对照组〔(0.00±1.62)%〕和模型组〔(0.00±0.48)%，P<0.05〕；其中25、30 g/L剂量组对Ha-cat细胞增殖抑制程度〔(59.38±6.59)%、(67.73±2.68)%〕明显高于20 g/L剂量组〔(9.51±4.93)%，P<0.05〕。模型组Ha-cat细胞凋亡率〔(4.25±1.37)%〕明显低于空白对照组〔(6.75±0.93)%，P<0.05〕；活血化瘀复方各剂量组细胞凋亡率均明显高于空白对照组和模型组(P<0.05)；其中30 g/L剂量组〔(29.88±3.20)%〕对Ha-cat细胞凋亡的促进程度明显高于20、25 g/L剂量组〔(8.61±1.59)%,(13.08±3.61)%，P<0.05〕。

2.3各组Ha-cat细胞Bcl-2、Bax mRNA和蛋白表达情况 模型组Ha-cat细胞Bcl-2、Bax mRNA和蛋白的相对表达量均明显低于空白对照组(P<0.05)；活血化瘀复方组各剂量组Bax mRNA和蛋白的相对表达量均明显高于模型组，且随剂量的增加逐渐提升(P<0.05)；活血化瘀复方组各剂量组Bcl-2 mRNA和蛋白的相对表达量与模型组相比虽有提升，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1，图2。

图1 各组Ha-cat细胞形态学变化(×200)

表1 各组Ha-cat细胞Bcl-2、Bax mRNA和蛋白表达量比较

与空白对照组相比：1)P<0.05；对模型组相比：2)P<0.05

1：空白对照组；2：模型组；3：20 g/L剂量组；4：25 g/L剂量组；5：30 g/L剂量组图2 Western印迹检测各组Ha-cat细胞Bcl-2、Bax蛋白表达情况

3 讨 论

细胞凋亡的分子调控机制复杂，多种基因参与其中。相关研究显示，Bcl-2家族可通过调控线粒体膜蛋白分泌和释放，参与细胞凋亡的发生、发展〔3〕；Bax为Bcl-2的促凋亡基因，与Bcl-2中的抑制凋亡部分相互结合，发挥拮抗作用，二者共同调控细胞凋亡进程〔4〕。TNF-α在银屑病发生中发挥重要作用：①TNF-α作为促炎因子，可调节免疫反应相关通路，引发体内强炎症反应〔5〕；②促进角质形成细胞的增殖〔6〕；③诱导T细胞VEGF mRNA高表达，而该因子在银屑病增生斑块形成等病理改变中发挥关键作用〔7〕。

活血化瘀方是根据本科多年临床经验总结而成，药物包括桃仁、红花、丹皮、玄参、丹参、鸡血藤、双花、蛇蜕、厚朴、甘草。桃仁、红花破瘀通络；丹参协同行心气，畅血脉；久瘀必留伏阳，双花清热解毒，玄参滋阴降火解毒；丹皮凉血破瘀与鸡血藤补血活血，推陈出新，加之配伍蛇蜕祛风止痒，营润肌肤，厚朴燥湿下气，甘草调和诸药，共奏活血化瘀；皮肤甲错的银屑病为瘀阻肤络型，上述组方对其有较好的疗效。经前期预实验发现，作用24 h，活血化瘀方粗提液对Ha-cat细胞的最小抑制浓度为20 g/L，半数致死量为24.50 g/L，相关系数为0.957；作用48 h，半数致死量为21.35 g/L，相关系数为0.872，已无明显细胞周期。因此，最终将活血化瘀方粗提液干预的低、中、高浓度设定为20、25、30 g/L，作用24 h。

本研究显示，活血化瘀复方各剂量组均可明显抑制Ha-cat细胞增殖并促进细胞凋亡，其中25、30 g/L剂量组效果更明显。进一步分析显示，给予活血化瘀复方干预后Bax mRNA和蛋白表达水平明显提升，Bcl-2表达变化不明显。提示Bax较Bcl-2与银屑病发病更具相关性，Bax基因可改变角质形成细胞分化水平，当低表达时会引发过度增殖；活血化瘀复方可通过上调Bax基因表达，诱导角质形成细胞凋亡，抑制Ha-cat细胞增殖，缓解银屑病。同时，Bax基因可能通过与其他基因相互拮抗，而非Bcl-2基因，实现上述促凋亡调控作用，有待进一步研究。

1沈立飞，王海英.黄芪注射液联合阿维A、复方氟米松软膏对银屑病患者外周血细胞因子的影响〔J〕.中国老年学杂志，2016；36(14)：3546-7.

2赵玉梅.活血化瘀法治疗寻常型血瘀型银屑病临床疗效观察及对血液流变学影响的研究〔D〕.济南：山东中医药大学，2012.

3陈 敏.皮肤感染患者病原菌种类和耐药性特点分析〔J〕.北华大学学报(自然科学版)，2015；16(4)：505-7.

4赵一晖，张晶莹，孙 兰，等.含醋酸氯已定复方洗手液的安全性研究〔J〕.中国卫生工程学，2016；15(1)：43-5.

5宋琳毅，周乃慧，王淼淼，等.寻常型银屑病患者血清白细胞介素-22水平与治疗转归的关系〔J〕.中国老年学杂志，2016；36(10)：2483-4.

6关 丽，刘冬舟.风湿免疫性疾病患者医院感染及病原菌分布调查研究〔J〕.中国卫生工程学，2017；16(3)：329-30.

7杨 楠.应用皮瓣修复面部皮肤缺损30例临床分析〔J〕.北华大学学报(自然科学版)，2017；18(4)：512-4.