丹参多酚酸盐对老年冠心病患者高密度脂蛋白功能的影响

张 涛 王旭兰 李秀红 李向阳 从国彬

(商丘医学高等专科学校，河南 商丘 476000)

冠状动脉粥样硬化性心脏病(CAHD)患者发病率和致死率极高，老年CAHD患者冠状动脉血管钙化严重，冠脉介入手术难度大，且大多数老年患者对手术持排斥态度，更希望药物保守治疗〔1～6〕。高密度脂蛋白(HDL)因其可逆向转运胆固醇而称作“血管清道夫”，HDL的血浆含量与心血管事件的发生呈负相关〔7,8〕。然而，大量关于提升血浆HDL含量的临床研究发现，HDL含量的单纯提升并没有减少相关心血管发生率，进而使研究者更加注重HDL功能学的改变〔9～14〕。丹参多酚因其具有活血、化瘀、通脉作用而被广泛应用于临床CAHD稳定性心绞痛患者，丹参多酚酸盐是否会影响HDL功能尚无报道。本研究拟阐明丹参多酚酸盐发挥心血管保护作用的分子生物学机制。

1 资料与方法

1.1研究对象 实验组为2016年3～12月就诊于陕西中医药大学附属医院心内科CAHD患者50例，年龄62～85岁，排除患有高血压、糖尿病、肾衰竭、严重感染性疾病等疾病的患者。对照组选取来陕西中医药大学附属医院健康体检的老年志愿者30例，年龄60～ 72岁。本研究已通过陕西中医药大学伦理委员会审核，参与者均签署知情同意书。两组一般资料见表1。

1.2HDL提取 抽取对照组及实验组〔入院当天及应用丹参多酚酸盐200 mg(上海绿谷制药有限公司50 mg/支)7 d后〕空腹静脉血，参考文献〔15〕，通过速梯度离心提取HDL：空腹静脉血离心(4℃ 4 000 r/min 10 min)后将血浆移入预冷的超高速管(38 ml，Beckman coulter公司)并按比例加入1∶500的乙二胺四乙酸(EDTA，134 mmol/L)和1∶10 000的二丁基羟基甲苯(BHT，200 mmol/L)后离心3次(4℃ 50 000 r/min 21 h)。每次离心结束后，血浆因其各个成分密度差异而分层，用无菌注射器小心吸取HDL并用0.22 μm的滤器(MerkMillipore公司)过滤后用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白浓度测定试剂盒(BCA Protein Assay Kit，Thermo Scientific 公司)测定其浓度，提取完毕的HDL存放于4℃冰箱备用(可有效储存3 w)。

1.3HDL抗氧化能力检测 按照文献〔16〕报道cell-free法检测抗氧化能力。将配置好的 CuCl2(21.7 μmol/L，Sigma公司)10 μl加入同等质量的实验组和对照组HDL内避光孵育，孵育至30 min时取10 μl配置好的〔双氯荧光黄乙酸乙酯(DCFH-DA)，Calbiochem公司，2.0 mg/ml〕加入正在孵育CuCl2的HDL内继续孵育30 min，孵育满1 h后用酶标仪(Spectra Max，Gemini XS；Molecular Devices，美国Molecular Devices)连续检测12 h读取相对荧光强度值(RFU)记录分析(理论上RFU值越高，抗氧化能力越弱)。

表1 对照组和实验组一般临床资料

与对照组比较：1)P<0.05

1.4HDL对内皮细胞一氧化氮(NO)含量的影响 取4代人脐静脉内皮细胞(HUVECs)种植于24孔板内至细胞铺满>95%后进行实验干预，实验分为5组：空白组不做任何处理；阳性对照组加入血管内皮生长因子(VEGF)50 ng/ml，对照组加入正常志愿者的HDL 100 μg/ml；实验组加入CAHD患者的HDL 100 μg/ml，丹参多酚组加入用丹参多酚酸盐1 w后的HDL 100 μg/ml。孵育30 min后用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，加入二氨基苯甲酸乙酯(DAF-2DA，10 μmol/L，Calbiochem)再次孵育30 min后使用荧光显微镜拍照(激发波长495 nm，发射515 nm)并记录。

1.5HDL对内皮细胞内源性NO合酶(eNOS)及其磷酸化位点Ser1177的影响 取4代HUVECs种植于6孔板内至细胞铺满>95%后进行实验干预，实验分为3组：空白组不做任何处理；对照组加入正常志愿者的HDL 100 μg/ml；实验组加入CAHD患者的HDL 100 μg/ml。孵育1 h后提取内皮细胞蛋白，通过Western印迹法检测各组HDL对eNOS蛋白及其磷酸化位点Ser1177影响的差异。

1.6统计学方法 用Graph pad prism5作图，采用SPSS11.0软件进行t检验及F分析。

2 结 果

2.1实验组、对照组和丹参多酚组HDL抗氧化能力 与对照组HDL(RFU值为380.2±51.66)比较，实验组HDL抗氧化能力明显减弱(RFU值为1 000.12±100.65，P<0.05)，丹参多酚组(RFU值为752.64±60.74)与对照组、实验组差异有统计学意义(P<0.05)。

2.25组HDL对内皮细胞NO含量影响 与空白组比较，阳性对照组和对照组明显促进内皮细胞生成NO，实验组促进内皮细胞生成NO的能力明显减弱，丹参多酚组一定程度改善HDL生成NO的能力。见图1。

图1 各组HDL对内皮细胞生成NO的影响(×40)

2.3各组HDL对内皮细胞eNOS蛋白活化的影响 与空白组比较，对照组HDL刺激内皮细胞中eNOS蛋白的活化；实验组HDL抑制内皮细胞中eNOS蛋白的活化。丹参多酚酸盐的应用可以部分恢复内皮细胞中eNOS蛋白的活化。见图2和表2。

图2 各组HDL对内皮细胞eNOS蛋白表达变化的影响

表2 各组HDL对内皮细胞eNOS蛋白活化的比较

1)与空白组比较；2)与对照组比较；3)与实验组比较：均P<0.05

3 讨 论

本研究结果阐明了丹参多酚酸盐在老年CAHD患者中发挥心血管保护功的分子生物学机制。CAHD所致心肌缺血有高致死性，尤其在老年患者中，因其冠状动脉血管钙化严重，且老年患者机体各个器官均处于终末期，其危险性不言而喻。然而目前临床上仍缺乏有效改善心肌缺血的方法。血管舒张功能受损被认为是冠心病的早期变化，而研究发现NO和eNOS在此过程中发挥了重要作用〔5〕。既往研究〔17〕表明：正常人的HDL通过活化eNOS信号通路，进而释放NO而促进血管舒张。研究发现〔18，19〕：正常人的HDL通过 PI3K/Akt和与细胞增殖紧密相关的蛋白激酶(RAS)/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路参与血管新生。研究显示疾病状态下的HDL无论是结构还是功能上与正常HDL均存在差异：CAHD患者HDL抗氧化能力减弱〔20〕；CAHD患者HDL丧失了活化Akt/eNOS等信号通路的能力〔21〕。李红文等〔22〕研究显示：CAHD患者HDL促进内皮细胞增殖、迁移的能力明显减弱。

研究发现〔23〕：丹参多酚可以降低人为冠状动脉结扎导致的犬急性心肌梗死的心电图ST段抬高程度、减少心肌梗死的面积、降低血清中低密度脂蛋白含量、部分抑制二磷酸腺苷(ADP)诱导的大鼠血小板聚集作用。本文结果说明丹参多酚酸盐可以部分修复CAHD患者HDL的心血管保护作用。

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