EMS诱变对北方白菜型冬油菜农艺性状与品质的影响

杨建胜，孙万仓,2，刘自刚,2，刘海卿，杨 刚，张树娟，张 晶，方 彦,2，武军艳,2，李学才,2

(1.甘肃省干旱生境作物重点实验室，甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室, 甘肃 兰州 730070;2.甘肃省油菜工程技术研究中心，甘肃农业大学农学院， 甘肃 兰州 730070)

化学诱变具有操作简单、突变性状稳定等优点，是创制植物新种质的有效途径，化学诱变剂甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulphonate，EMS)具有点突变频率高且多为显性突变体以及突变体易于筛选等优点[1]。关于EMS诱变产生突变体的研究已有大量报道，王英培等[2]用EMS处理大豆，筛选出一批高蛋白(45%～50%)、高亚油酸(60%以上)、低亚麻酸的优良突变系；曲高平等[3]用EMS处理甘蓝型油菜中双9号干种子，从M2突变体库中筛选到3株苯磺隆抗性突变体，创建了包括子叶、叶片、花器、株型、角果等多器官变异类型的突变体库；廖晓英等[4]利用EMS处理甘蓝型油菜玻里马胞质雄性不育系(polcms)的保持系2B种子，从田间M2诱变群体中筛选获得多分枝和长角果等占M2诱变群体7.4%的1 495个变异株；薛远超等[5]分别从GH18和中双9号的EMS诱变后代中筛选得到14个和2个强耐湿性材料；陈洁等[6]也通过EMS诱变甘蓝型油菜获得了耐湿种质资源。此外，EMS处理对油料作物脂肪酸品质改良具有重要作用，是一种安全有效的育种方法。黄永娟等[7]用0.4% EMS诱变甘蓝型油菜NJ7982种子，从M2筛选得到1个油酸含量为76.15%的突变株；张宏军等[8]采用浓度1.5%EMS处理甘蓝型油菜后发现其对油酸含量有一定的影响，同时发现高油酸材料FAD2A中第205位残基天冬氨酸变成甘氨酸，FAD2B中第241位残基酪氨酸变成苯丙氨酸，并且二者都发生在油酸减饱和酶催化中心，从而影响蛋白质的空间结构，导致油酸含量提高；德国学者Hans-Joachim Harloff等[9]发现EMS能使甘蓝型油菜品质性状发生改变，通过诱变得到了低芥酸的突变体。北方地区冬季严寒、干旱，自然条件严酷，强冬性白菜型冬油菜抗寒性优异，是我国北方旱寒区唯一能够越冬的冬油菜，近年来生产发展十分迅速，正在成为该区重要油料作物和生态作物，但北方强冬性白菜型冬油菜品种品质不好，芥酸与硫苷含量高，缺乏优质种质资源，同时株型不适应现代种植业发展要求，农艺性状等也不尽理想。因此，创制白菜型冬油菜优质种质资源、改良北方白菜型冬油菜的品质和农艺性状是北方强冬性白菜型冬油菜育种研究的重要内容，本试验以白菜型冬油菜陇油7号为材料，用不同浓度EMS溶液进行诱变处理，以期明确EMS诱变对北方强冬性白菜型冬油菜的品质和农艺性状的影响，为白菜型油菜的品质改良提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

白菜型冬油菜超强抗寒品种陇油7号种子，由甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室提供，化学诱变剂为甲基磺酸乙酯(EMS)，购自美国Sigma公司，原液浓度为10 mol·L-1。

1.2 试验设计

2013年9月在甘肃农业大学试验农田进行大田试验，试验地肥力中等，播前翻耕整地，清除杂草，将用5种不同浓度EMS溶液处理后的种子于2013年9月8日播种，试验设3次重复，完全随机区组设计，开沟条播，播深4 cm左右，深浅一致，行距20 cm，株距7 cm左右，播后及时沿播种沟镇压保墒，此后常规管理。室内试验在甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室进行。

1.3 试验方法

1.3.1 EMS处理方法 用0.1 mol·L-1、pH值7.0的磷酸缓冲液配制不同浓度(0、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%)的EMS溶液，分别标记为CK、T1、T2、T3、T4。选取大小均匀，形状饱满的陇油7号种子4 500 粒，置于15个10 mL的离心管中(每300粒装1个离心管)，先用蒸馏水浸泡种子10 h，随后倒掉蒸馏水，倒置离心管于滤纸上吸干种子表面水分，再向离心管中加入不同浓度的EMS溶液，在恒温(22℃)下处理6 h，处理完后用无菌水冲洗种子10次，流水冲洗过夜。种子晾干后于大田播种，每处理重复3次，按常规方法管理。

1.3.2 M1的田间观察方法 播种1周后调查统计成苗率，于苗期观测植株的形态特征(子叶形状、心叶色、基叶叶型等)，蕾薹期观察植株的株型、叶形、叶色、现蕾情况等，花期调查花器颜色、形态和育性等，成熟期各处理每重复随机选取15株对株高、分枝部位、有效分枝数、主花序有效长度、主花序有效角果数、全株有效角果数、角果长度、角粒数、千粒重等性状进行考种以及生育期的调查，单株编号收获进行品质测定。

1.3.3 M2种子的品质分析方法 2015年6月收获M2种子，单株编号收获，种子脱粒晾干后用近红外分析光谱仪器(上海费尔伯恩精密仪器有限公司，BOEN-SUP-2700)[10]测定软酯酸、硬酯酸、芥酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、二十碳烯酸、含油量(CE)、硫苷(GSL)、水分及粗蛋白(GP)，重复3次。

1.4 数据分析

数据处理和分析均采用Excel和SPSS 16.0软件。

2 结果与分析

2.1 EMS处理对冬油菜M1成苗率的影响

用EMS处理的种子播种1周后田间成苗率的调查结果表明，EMS对成苗率有抑制作用，且随着浓度的增加抑制作用增强，苗致死率增高。经0.6%浓度处理后种子的成苗率为52%，说明此浓度下苗致死率接近50%，从发芽时间来看，与CK相比，所有EMS处理后种子出苗较慢且不均匀，经高浓度EMS(T4)处理后，种子发芽后子叶黄化而迅速死亡，导致成苗率只有37%(表1)。

表1 不同浓度EMS处理后种子成苗率/% Table 1 Seeding rate after treatment with different concentrations of EMS

注：成苗率指观察当天田间的植株数占种子总数的百分比；不同字母表示在0.01水平有显著差异(P<0.01)。

Note: seeding rate refers to the percentage of the number of plants observed in the field to the total number of seeds; different letter indicated significant difference at the 0.01 level(P<0.01).

2.2 EMS处理对M1植株的影响

2.2.1 对苗期植株的影响 EMS对苗期植株的影响主要反映在植株的生长量上，即植株的形态大小。由图1和表2可知，经EMS处理的油菜生长普遍较CK弱，表现为CK>T1>T2>T3>T4，同一浓度下植株的长势差异不明显，说明EMS对油菜的生长发育有一定的抑制作用，且抑制作用与浓度呈正相关，且在高浓度EMS处理下，出现叶片黄化的现象(图1-D、E)，这将影响植株后期的生长发育。

表2 冬油菜五叶期植株的干鲜重/g Table 2 Fresh and dry weight of plants at five-leaf stage

2.2.2 植株叶片产生的变异性状 不同浓度EMS处理陇油7号种子，各浓度下，蕾薹期植株田间表现有叶片卷曲、皱缩、畸形、黄化等变异性状。CK的叶片厚而叶色深(图2-A)，而在M1植株中出现了叶片边缘下卷，叶片变小(图2-B)、叶片皱缩(图2-C)、叶尖畸形(图2-D)、整个叶片畸形(图2-E)、一半白叶一半绿叶(图2-F、G)、黄斑叶(图2-H、I)、叶边缘黄化以及黄化叶(图2-J、K、L)等变异植株。在这些变异性状上，后期一些植株慢慢死亡或死蕾而不能收获种子。

图1 不同浓度EMS处理后油菜的田间表现

Fig.1 Rapeseed field performance of different EMS treatments

2.2.3 植株花器官产生的变异性状 白菜型油菜陇油7号的花序为总状无限花序，正常花有4个花瓣，呈十字对称分布，颜色为黄色(图3-A)，但在诱变后代中出现了不正常花，在花瓣数目上出现了2个花瓣的植株，另外2个花瓣萎缩而不发育(图3-B、C)；3个花瓣的植株，1个花瓣萎缩(图3-D)；5个花瓣的植株，在正常花瓣的下面又叠生出1个花瓣来(图3-E)；6个花瓣的植株，也是在正常花瓣的下面叠生出1个花瓣，且有3个花瓣连生在一起(图3-F)。在花瓣形态上出现了花瓣卷曲、花瓣皱缩变小的变异株(图3-G、H)，也有花瓣大小不一且不对称的不正常花(图3-I、J)。在花瓣颜色方面出现了黄白相间花的植株(图3-I、J)及白花植株(图3-K)，白花植株的花瓣较小而整个花瓣全是白色。此外，还出现了多柱头而无雄蕊和花瓣的畸形变异花(图3-L)。

2.2.4 对成熟期植株的影响 在成熟期各处理随机选取15株进行考种，由表3可知，EMS对株高的影响是随着EMS浓度的增加，株高逐渐降低，各浓度下株高与CK的差异达到显著或极显著水平。随EMS浓度的增加有效分枝数增多，这主要表现为植株的丛生现象，与CK相比，分枝数多但株型矮小、叶片较小、茎杆纤细、长势较弱，矮化丛生是这一时期典型的变异特征。EMS对其它性状的影响都是随着EMS浓度的增加各性状发育受到抑制，T4中，除有效分枝数和角果长度外，其它性状与CK的差异均达到显著或极显著水平，说明EMS浓度越高，其对各性状的发育抑制程度越高。此外，EMS对株高、主花序有效角果数和全株有效角果数的影响最大，株高变小，有效角果数变少，这也是其影响单株产量的主要原因。

图2 冬油菜EMS诱变后代在叶片性状上的变异表现 Fig.2 Leaf morphological traits of the mutants induced by EMS

图3 冬油菜EMS诱变后代在花器上的变异表现 Fig.3 Morphological traits of floral organ of the mutants induced by EMS表3 不同浓度EMS处理后油菜成熟期植株的田间表现 Table 3 Agronomic traits of plants at maturity after treatment with different concentration EMS

注：*和**分别表示与CK相比在0.05和0.01水平上差异显著。Note: *, ** significant difference atP<0.05 and 0.01 levels, respectively.

经调查，各浓度处理下植株的生育期随着EMS浓度的增加而延长，CK的生育期为288 d左右，T2的生育期为295 d，较CK延长1周左右，而T4的生育期较CK推迟2周左右，这可能是EMS对其植株在各个生育期的生长发育都有一定的抑制作用所致，从M1植株的各个生育期来看，苗期植株的变异不大，变异主要反映在抽薹期和花期。

2.3 冬油菜M1种子各主要脂肪酸间以及与含油量的相关与回归分析

由表4可知，软酯酸与油酸，亚油酸与亚麻酸，芥酸与硬脂酸、亚麻酸在P=0.05水平上相关性不显著，其它脂肪酸间均存在显著或极显著相关关系，油酸除与亚油酸呈极显著正相关(r=0.374)外，与硬脂酸、亚麻酸、二十碳烯酸、芥酸间均呈极显著负相关，相关系数r依次为-0.706、-0.744、-0.962、-0.615。在白菜型油菜品质改良育种中，获得双低(低硫苷、低芥酸)油菜新品种以及油酸含量高芥酸含量低的突变体材料是育种工作者的理想目标，油酸与芥酸间的负相关性，体现出获得理想突变体材料的可能性，为白菜型油菜品质改良育种提供理论依据，且油酸和芥酸的回归系数为-0.4798，即芥酸含量每下降1%，油酸含量可增加0.48%。芥酸与油酸、亚油酸间均呈极显著的负相关关系，相关系数r依次为-0.717、-0.615、-0.866，而二十碳烯酸与油酸和亚油酸间也呈极显著的负相关关系(r为-0.962、-0.324)，且芥酸与二十碳烯酸间呈极显著的正相关关系(r=0.501)。

表4 油菜诱变后代种子各主要脂肪酸的相关性及其对应的线性回归方程 Table 4 The correlation and linear regression equation of the main fatty acids in the seeds of mutagenesis progeny

注：表中数据为相关系数，括号中为对应的回归方程; *和**分别表示在0.05和0.01水平下相关性显著。

Note: the table date is correlation coefficients, and that within brackets is regression equation; * and ** mean significant correlation at level of 0.05 and 0.01, respectively.

含油量与软脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸间均呈极显著的负相关关系，相关系数r依次为-0.776、-0.301、-0.875、-0.269，与硬脂酸、芥酸间呈极显著的正相关关系(r为0.374、0.836)，而与二十碳烯酸间呈显著正相关关系(r=0.216)。

2.4 冬油菜M1籽粒品质性状分析

通过对各处理M1主要脂肪酸含量分析发现，在各浓度处理后，油酸含量高于CK(33.24%)的植株占总植株数的41.9%，油酸含量大于40.0%的植株占总植株数的13.97%，在T1中出现了1株油酸含量为44.02%的植株，在T2中出现了2株油酸含量较高的植株，油酸含量分别为44.04%、44.18%，比CK高11个百分点左右。芥酸含量低于CK(24.70%)的植株占总植株数的50.7%，芥酸含量较低(低于15.0%)的植株占总植株数的11.0%，在T1、T2中分别出现了2株芥酸含量较低的植株，芥酸含量分别为7.49%、8.93%、9.51%和8.50%，比CK低17个百分点左右。硫苷含量低于CK(93.10%)的植株占总植株数的63.97%，硫苷含量较低(低于40.0%)的植株占总植株数的9.56%，在T1、T2中分别出现了1株硫苷含量较低的植株，硫苷含量分别为5.44 μmol·g-1和15.32 μmol·g-1。在这些突变株中出现了4株芥酸和硫苷含量均较低的突变株，其芥酸和硫苷含量分别为7.49%和26.21 μmol·g-1、10.94%和5.44 μmol·g-1、8.93%和28.94 μmol·g-1、9.51%和34.22 μmol·g-1(表5)。

表5 EMS处理对油菜主要脂肪酸含量的影响/% Table 5 Effects of EMS treatment on major fatty acid contents of mutants

2.5 冬油菜M2获得的优质突变体及其主要品质性状

在M2中检测到4株有利突变体，分别为3株油酸含量较高(比CK高15个百分点左右)且芥酸含量较低(比CK低10个百分点左右)的突变株，1株低硫苷含量突变体(表6)，这些突变株的出现进一步说明了EMS诱导北方白菜型冬油菜产生优质突变体的有效性。

3 讨 论

3.1 EMS诱变可使北方白菜型冬油菜产生较大变异

诱变可以产生丰富的突变体，已广泛应用于植物遗传育种和生物学研究[1]。EMS作为一种有效的诱导植物基因发生点突变的手段，在小麦[11]、大豆[12]、玉米[13]、水稻[14]等作物上取得了较好效果，中国科学院石家庄现代化研究所利用EMS处理冬小麦，获得了比原品种蛋白质含量高3%～40%的突变体，其中M2变异率达到15.7%以上, 获得9个早熟、矮秆突变系，比原品种增产2.8%～20.5%[15]；将浓度为0.1%～0.5%的化学诱变剂EMS注入花生品种花育16号和鲁花11号的花器，获得了单株结果数、单株仁重、饱果率比野生型明显提高的突变体，同时对花生的品质和农艺性状也产生了明显影响[16-18]。本研究结果表明，EMS对白菜型冬油菜M1植株蕾薹期和花期形态特征和农艺性状影响较大，在蕾薹期出现了叶片白化、卷曲、皱缩、畸形、黄化、花器畸形植株，尤其在花期出现了2花瓣花、3花瓣花、5花瓣花、花瓣皱缩卷曲、黄白相间花、白花以及多柱头花等变异性状，这与前人在甘蓝型油菜上的研究结果类似[19-20]。

表6 突变体的主要品质性状 Table 6 Quality traits of the resulting mutant

3.2 变异的产生与EMS处理的浓度和时间有关

研究表明，EMS诱变无论产生有利或有害变异，均与诱变剂的浓度和处理时间有关，且不同的植物材料诱变效果也不同[21-25]。李伟等[26]发现谷子豫谷1号的适宜诱变条件为清水浸种过夜、1%EMS处理8 h；水稻上发现用0.5%EMS溶液处理的水稻种子，再经0.5%和0.7% EMS溶液复合处理，发生突变的频率为12.4%，复合处理的诱变效果优于一次性处理，在M3筛选到一个生产上能推广使用的水稻突变新品系[27]。本研究结果表明，适宜的EMS浓度是提高诱变效率的关键，成苗率随EMS浓度的增加而减小，EMS浓度为0.6%时，田间种子的成苗率为52%，接近半致死浓度，而0.3%处理后籽粒品质产生的变异幅度也较大，综合这2个指标，确定其诱变最适浓度为0.3%～0.6%，此浓度范围可作为白菜型油菜EMS诱变的参考浓度。本研究中变异性状的出现，证明EMS在白菜型油菜上的应用是有效的，成熟期的考种结果表明，EMS对株高、分枝部位、主花序有效长度等性状的发育有一定的抑制作用，且抑制作用与浓度成正相关。

3.3 EMS诱变可成为北方白菜型油菜产生优良突变体的有效途径

近年来人们越来越关注油菜的品质，通过理化因素诱变已成为创建新型优质种质资源的一种有效手段[1]。本试验在M2中筛选到了3株油酸含量较高且芥酸含量较低的植株(编号分别为M2-646-07、M2-646-11、M2-710-03)，油酸含量分别为48.56%、47.57%、45.08%，比对照高15个百分点；芥酸含量分别为17.89%、19.03%、19.37%，比对照低10个百分点，同时还得到了1株硫苷含量较低(21.97 μmol·g-1)的突变株(编号为M2-812-79)，前人研究表明，EMS处理甘蓝型油菜种子产生高油酸突变体，其原因可能是：高油酸突变体中，BnFAD2I基因有63个碱基发生变异，进而导致蛋白质翻译出现终止；BnFAD2II-1基因有41处碱基发生突变，导致15个氨基酸变异，其中处于跨膜区域的+82氨基酸由丝氨酸突变成脯氨酸，+157的苯丙氨酸变成亮氨酸，位于疏水区中，还有9处发生突变的氨基酸残基位于α-螺旋区，这些突变位点都发生在油酸脱饱和酶催化中心，进而影响该酶的活性，导致突变体的油酸含量升高[7]，而对于EMS处理对油菜芥酸和硫苷含量的影响还有待进一步研究。

4 结 论

本研究表明，甲基磺酸乙酯(EMS)处理可诱导北方白菜型冬油菜产生丰富的变异，在M1代中出现叶片、花器官、农艺性状及品质性状的变异；在M2中筛选到了3株油酸含量较高且芥酸含量较低的突变体(油酸含量45.08%～48.56%、芥酸含量17.89%～19.37%)和1株低硫苷突变体(硫苷含量21.97 μmol·g-1)；能使白菜型冬油菜产生有利变异的EMS处理浓度为0.3%～0.6%，处理时间为6 h。

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