锚蛋白G对心脏钠通道影响的研究进展

刘剑，颜素娟

(南昌大学第二附属医院，南昌330006)

在心肌细胞中离子通道和运载体的调节活动对正常的兴奋收缩偶联和心脏收缩节律来说非常重要。过去研究表明，具有调节离子通道的生物物理学特性的人类基因变异与致命性心律失常有着紧密的联系。锚蛋白是一类链接蛋白，在心血管系统中，锚蛋白是离子通道和运载体信号复合物的重要组成部分；在兴奋性细胞中，锚蛋白对钠离子通道(Nav)和运载体的正确表达及膜上的定位起关键作用。最近研究表明，对Nav定位有影响的锚蛋白G为基础的途径基因变异与Brugada综合征的致命性心律失常有关。在发生心肌梗死犬的心脏梗死边界区的心肌细胞中，锚蛋白G参与钠电流(INa)的重构。这些研究都表明这些重要的分子事件在可兴奋细胞中参与了细胞膜域的构成。甚至，把心脏“通道疾病”引起的心律失常归因于适宜的通道靶向性和定位的缺陷。而离子通道的靶向性和定位与锚蛋白G又有不可分割的关系。现将锚蛋白G对心脏钠通道影响的研究进展综述如下。

1 锚蛋白生物学特性

锚蛋白是一种胞内蛋白，其能构成、转运和定位膜蛋白复合物到肌动蛋白或血影蛋白细胞骨架上,从而，在具有明显功能特征的膜里形成微结构域。在锚蛋白家族中，常见的蛋白主要有：锚蛋白R、锚蛋白B、锚蛋白G。典型的锚蛋白及其不同的剪接变异体主要由三种互为独立的基因(ANK1，ANK2和ANK3)编码。ANK1位于人染色体8p11上，主要编码锚蛋白R。ANK1主要在红细胞和一些肌肉与神经元上表达[1]。ANK2位于人染色体4q25-27上，主要编码锚蛋白B。ANK2主要在大脑、心脏、胸腺上表达[2]。ANK3位于人染色体10q21上，主要编码锚蛋白G。ANK3主要在大脑、肾脏、骨骼肌和心脏上表达[3]。典型的锚蛋白有四种结构域组成。它们分别是膜结合域(MBD)、血影蛋白结合域(SBD)、死亡域(DD)和C-末端(CTD)。锚蛋白MBD是由24个ANK基因的重复序列构成，并形成连续的螺旋样结构。MBD并不直接与细胞膜结合，而是通过与多种膜蛋白结合。这些膜蛋白通常有：离子通道，运载体及细胞黏附分子。MBD的功能是由ANK重复序列进行调控。重复序列形成许多反向平行的α-螺旋结构，并通过β-转角环尖的垂直排列与这些α-螺旋结构发生联系[4]。这些被暴露的环尖对锚蛋白与膜蛋白间的相互作用具有特异性。如 1， 4，5-三磷酸肌醇受体与编码220 kD锚蛋白-B的ANK重复序列22-24的β-转角环尖的相互作用[5]。同时MBD能与不同的膜蛋白进行结合，并形成多种膜蛋白复合物。又如锚蛋白-R膜结合域对L1细胞黏附分子神经束蛋白有2个结合位点[6]，这些结合位点能调控锚蛋白R与阴离子交换剂的二聚物相互作用[6]。锚蛋白SBD是一个大小为62 kD的结构区域，也是锚蛋白的结构中心。具有对锚蛋白和以血影蛋白或肌动蛋白为基础的细胞骨架的调节功能。研究表明，锚蛋白和β-血影蛋白间的相关性可能与锚蛋白对血影蛋白/肌动蛋白的细胞骨架结构的维持作用有关。如在小脑神经元里随着锚蛋白G的表达受到破坏，β4-血影蛋白含量发生减少[7]。锚蛋白DD是一个含有90个氨基酸构成的结构区域，具体的功能尚不清楚。但被认为DD可能促进同型蛋白与异型蛋白间联系作用。在肾小管里锚蛋白G的死亡域与促凋亡分子Fas有相互作用关系[8]。锚蛋白CTD在不同的锚蛋白基因产物中的含量是有差别的，并且CTD对锚蛋白基因产物的调控具有十分重要的意义。如缺乏161残体锚蛋白-R的剪接变异体对血影蛋白及阴离子交换剂的亲和力要比其全长度的高[9]。

2 锚蛋白G依赖性细胞途径

在神经细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞的电活动中都需要Nav。在心脏Nav1.5是最主要的Nav。Nav1.5依赖性活动具有调节心脏动作电位快速去极化过程。Nav1.5的活动需要精确地定位于特定的心肌细胞膜结构上。而锚蛋白G MBD与Nav1.5 DⅡ～DⅢ环的直接相互作用是Nav1.5表达和定位于心肌细胞膜表面上的基础。对于心肌细胞和其他可兴奋性细胞来说，锚蛋白G依赖性Nav1.5靶向定位是兴奋产生过程中必不可少的一步。锚蛋白肽通过与心脏动作电位相关的靶向性关键性离子通道或运载体来规律地调控心脏活动。锚蛋白G直接与Nav1.5靶向于膜表面来调节内流的INa有关，并与动作电位开始和心肌细胞的去极化有关。此外，Prosenjit等使用慢性肠道炎症的兔子模型研究发现，在慢性肠道炎症过程中，Na-K ATP酶的定位发生改变后就会引起锚蛋白G的下调。而锚蛋白G的下调将导致Na-K ATP酶活性下调[10]。在心肌细胞中锚蛋白G是Nav1.5生理学意义上的结合“伙伴”。研究表明，锚蛋白G减少的心肌细胞表现出Nav1.5的表达减少，膜上定位异常以及Nav电流密度减少[11]。通常把这种结构上的需求定义为锚蛋白G对Nav1.5的相互作用。同时Nav1.5细胞膜上的定位异常是由于Nav1.5-锚蛋白G间相互作用的消失。锚蛋白G对心脏的去极化及可兴奋性组织上Nav活动起着关键性作用。

3 锚蛋白G对心肌细胞兴奋性的调节

通过对各种离子通道和运载体的聚集，锚蛋白G对神经元和心肌细胞的膜兴奋性进行支配。而最新研究显示，锚蛋白G通过胱氨酸的棕榈酰化将自身定位于细胞质膜上特定区域。锚蛋白G的膜锚定是通过棕榈酰化接合到脂质膜上并形成一个稳定的结合界面，而无棕榈酰化的锚蛋白G更倾向于待在膜附近，但没有形成一个独立的结合面。在近膜区锚蛋白G通过胱氨酸的棕榈酰化后接受脂质的调控，此过程一旦发生，锚蛋白G就形成了一个严格的结构基础，在此基础上可以形成膜激发平台[12]。 Nav对心脏的动作电位快速上升期和心脏的传导功能有十分重要的意义。Nav1.5在心肌润盘上的表达能促进动作电位的产生。Scn5a是编码Nav1.5主要基因，当Scn5a变异和(或)Nav功能障碍都会引起一系列心血管系统疾病。包括：窦房结功能障碍、房颤、室性心律失常和心功能衰竭。锚蛋白G是一种衔接蛋白，与Nav1.5有着密切联系。类似于神经元上的Nav，在Nav DⅡ～DⅢ细胞内环中Nav1.5具有保护锚蛋白结合基序作用。而这种基序对Nav1.5的靶向性和定位到润盘上起到非常重要的作用。减少细胞中锚蛋白G含量将减少Nav1.5在心肌细胞膜上的表达，并且单个心肌细胞总的INa密度也将减少50%～60%[13]。同样，Nav1.5膜上的表达和总的INa密度减少主要是锚蛋白结合域上的错义变异，这种错义变异废除了锚蛋白G/Nav1.5相互作用[14]。锚蛋白G能促使Nav1.5定位于心肌细胞润盘上。一般认定的锚蛋白G链接基序的缺失，将导致Nav1.5与锚蛋白G发生失联。锚蛋白G的功能缺陷将导致Nav表达、定位、功能等的障碍。同时，锚蛋白G在心脏里也是一种多功能的调节蛋白。它具有诱导βⅣ血影蛋白和钙/钙调素依赖蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)到心肌细胞润盘上。以及促使CaMKⅡ调控Nav1.5的磷酸化。在锚蛋白G基因敲除老鼠实验中发现老鼠出现明显的房室传导功能受损，主要表现为其心电图上的P-R间期延长；房内传导功能也表现出下降，主要表现为心电图上P波持续时间延长[15]。此外，心电图上还有QRS波的增宽[15]。同时，锚蛋白G基因敲除的老鼠也出现明显的心脏功能改变的表现，包括：射血分数下降，心脏收缩期末和舒张期末的心腔直径增大，心腔的前后壁增厚。βⅣ血影蛋白是一种具有结合锚蛋白G的肌动蛋白相关肽。并且在神经系统中，对锚蛋白G的正常定位βⅣ血影蛋白起着非常重要的作用。以βⅣ血影蛋白/锚蛋白为基础的复合物对Nav1.5和细胞兴奋性调节起着决定性作用。特别是βⅣ血影蛋白能与锚蛋白G、Nav1.5及CaMKⅡ在心肌细胞润盘区域表达。而CaMKⅡ能调节Nav1.5的活动。同时，βⅣ血影蛋白具有保护C末端的氨基酸序列，这一特性在Cav1.2的β2a亚单位里类似于CaMKⅡ结合基序和CaMKⅡ自我调节域。βⅣ血影蛋白直接通过C末端基序结合CaMKⅡ，并能与锚蛋白G、Nav1.5及CaMKⅡ在体内构成一系列复合物。Nav1.5的血影蛋白基本调节主要通过位于DⅠ-DⅡ连接区域的CaMKⅡ直接磷酸化通道。

在心脏锚蛋白G可能通过胱氨酸的棕榈酰化后接受脂质的调控，形成了一个严格的结构基础，促使信号蛋白到润盘上，并对Nav1.5起调控作用。锚蛋白G通过βⅣ血影蛋白的诱导作用将CaMKⅡδ定位于心肌细胞润盘上，并随着CaMKⅡδ磷酸化Nav1.5来调控心肌细胞的兴奋性。锚蛋白G相关的通路与心脏的电生理、信号通路以及结构有关，无论是否有心脏病变。Nav1.5的锚蛋白结合基序发生变异，与心肌细胞INa消失，Nav定位异常及人类的Brugada综合征和窦房结功能障碍均有关。同时锚蛋白G基因微小的变异可能引起窦房结病变、心律失常，甚至是结构性心脏病。这些病变与心肌细胞润盘的基本结构缺陷有关。

4 以锚蛋白G为基础的Nav1.5通道靶向途径与Brugada综合征

Brugada综合征是一种常染色体遗传病。这种具有潜在致命性心律失常的病变在心电图上主要以胸前区导联(V1、V2、V3)ST段抬高伴右束支传导阻滞和T波倒置为特点。在受此病影响的个体中，由于发生室颤常在夜间死亡。30%Brugada综合征患者是由于SCN5A基因变异引起。SCN5A的变异引起Nav1.5的生物物理学方面特性缺陷，进而扰乱了Na离子的内流。在2002年，Brugada综合征研究奠基者Priori和她的团队证实了G3157A SCN5A的变异。随后分析揭露Nav1.5 E1053K变异是位于Nav1.5 DⅡ-DⅢ的锚蛋白结合基序上。在成年大老鼠心肌细胞实验研究中，Nav1.5 E1053K表现为润盘和横小管的靶向异常。因此，人类的Brugada综合征与影响正常Nav1.5膜靶向性的SCN5A的变异有关。而锚蛋白G在Nav1.5通道的生物物理学特性上可能扮演着一种无法预料的辅助性角色。特别是在比较分析HEK293细胞时，缺失锚蛋白链的Nav1.5 E1053K对通道的活化、快速失活及缓慢恢复较野生型的通道展现出一种负性作用。因此，锚蛋白G对于Nav定位到心肌细胞上的细胞机制起着关键性作用。SCN5A的变异破坏了锚蛋白G与Nav1.5的相互作用，从而导致Nav1.5在心肌细胞上的定位出现异常。

5 锚蛋白G参与心梗后Nav的重构

在心肌梗死犬心脏的边缘区域中，心脏Nav重构对折返型心律失常的产生提供一个关键因素。而Nav1.5聚集现象和功能与锚蛋白G、缝隙链接蛋白和机械链接蛋白有密切联系。心肌梗死后Nav1.5和锚蛋白G重构发生较心肌梗死后缝隙链接蛋白和机械链接蛋白重构要晚。在心肌梗死后浦肯野纤维细胞中缝隙链接蛋白和机械链接蛋白的重构发生在冠状动脉闭塞48 h后Nav结构和功能消失时。缝隙链接蛋白和机械链接蛋白重构出现较早可能有利于维持Nav1.5的亚单位位置和功能。

心脏组织结构中，脉冲波的形成依靠心肌细胞的兴奋性和心肌细胞间电流的传导。单个心肌细胞的兴奋主要由Nav1.5所决定。分离心梗5 d后犬的心外膜区的心肌细胞表明，Nav功能的改变在心脏传导功能减慢中起着重要的作用，并也是心梗后发生心律失常的基础。而Nav1.5不仅与锚蛋白G有关，而且与锚蛋白G靶向于润盘上有密切关系。研究表明，在心梗区的心肌细胞有明显的Nav1.5蛋白结构重构现象。当Nav1.5和INa均减少时，锚蛋白G蛋白表达增加和移置到心肌梗死后残存的有活性心肌细胞膜下区域。同时，在心肌梗死5 d后犬的梗死区心肌细胞INa的改变中发现，锚蛋白G明显与心肌细胞的电重构有密切关系。实际上，在Nav功能和结构消失时，锚蛋白G表达是增加的。心脏Nav有明显的储备功能，其功能最佳的时候需通过锚蛋白G的定位和锚定。在缺血重构的急性期，锚蛋白G的含量通过钙的活动及钙依赖性钙蛋白酶的作用快速地减少。因此，在心肌梗死48 h后，锚蛋白G含量的升高并稳定地调节Nav1.5蛋白募集到肌纤维膜上。

锚蛋白G涉及到Nav1.5在心肌细胞膜上特异性定位的机制，但是这种蛋白途径的辅助性角色所起的作用机制仍然不明确。有学者认为Nav的病变主要与Nav在心肌细胞上的定位异常有关。通常遗传性心律失常综合征的病因很少被考虑为与心脏的离子通道和相关亚单位的生物物理学特征影响有关。在过去几十年对锚蛋白的研究认为，作为一种膜链接蛋白的锚蛋白在特异性心律失常综合征的病因中起着关键性作用。从而使人们对疾病的病因学方面的研究由分子结构逐步发展到细胞的组成方向。锚蛋白G调控Nav1.5定位心肌润盘及促进膜表面的表达呈现出对心律的未来治疗方法-基因靶向治疗或目的蛋白合成治疗法。通过调控锚蛋白的活动治疗心律失常和心衰。

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