干细胞分型及其治疗缺血性心肌病机制的研究进展

王红阳，刘家袁, 梁贵友，余丽梅

(1遵义医学院附属医院,贵州遵义563000；2贵州省组织损伤修复与再生医学协同创新中心)

缺血性心肌病是指由于长期心肌缺血导致心肌局限性或弥漫性纤维化，从而产生心脏收缩和舒张功能受损，引起心脏扩大或僵硬、充血性心力衰竭、心律失常等一系列临床表现的临床综合征。目前，临床中多采用药物、介入手术及冠脉旁路移植术等方式对患者进行治疗，减缓疾病的进展，一定程度改善心脏功能，然而由于心肌细胞的缺血坏死，预后多不理想。近年来，随着对干细胞临床研究的深入及干细胞技术的逐渐成熟，人们发现干细胞移植可通过促进血管新生、心肌再生及旁分泌等作用改善心功能，有望成为治疗缺血性心脏病的新举措，心脏干细胞(CSCs)的再生修复等也逐渐成为新的治疗靶点。由于其种类较多，因此不同的干细胞治疗缺血性心肌病的作用机制也不尽相同。本文就干细胞分型及其治疗缺血性心肌病的研究进展进行综述。

1 干细胞的类型

干细胞具有自我更新和多向分化潜能，具有多种功能活性，一定条件下，可以在体内外诱导分化为心肌细胞、肝脏细胞、神经细胞、成骨细胞和脂肪细胞等多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段可分为胚胎干细胞和成体干细胞。根据干细胞的发育潜能可分为全能干细胞、亚全能干细胞、多能干细胞及单能干细胞，因其具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，被称为“万用细胞”。移植的干细胞主要包括两大类：成体干细胞和多功能干细胞，主要包括骨骼肌成肌细胞、胚胎干细胞(ESCs)、骨髓来源干细胞(BMSCs)、羊膜干细胞及CSCs等。

1.1 骨骼肌成肌细胞 骨骼肌成肌细胞是一类位于细胞膜和肌膜之间可以分化为骨骼肌细胞的起源细胞，可在创伤后增生、重构肌肉组织。是目前临床实验和研究中移植应用最多的细胞之一，具有耐受缺血、缺氧环境；定向分化成具有横纹肌特性的肌细胞；易提取、分离、培养和增殖等特点。移植后，骨骼肌成肌细胞虽不能转分化成心肌细胞，但能与心肌细胞以合胞体的状态结合，提高心肌的收缩力[1]。然而，Abreham等[2]研究指出移植入梗死区的骨骼肌成肌细胞只能分化成保留骨骼肌特征的心肌细胞，不能与周围的心肌细胞形成电生理偶联，可引起心律失常的发生。采用慢病毒转染技术将Wnt基因转入骨骼肌成肌细胞，结果发现转染后的细胞中心肌早期标志物相关基因NKx2.5和连接蛋白43(Cx43)以及晚期心肌标志物相关基因α、β肌球蛋白重链和脑钠尿肽mRNA表达水平升高[3]，表明转入的Wnt基因可以促进骨骼肌成肌细胞转分化为心肌细胞，转基因的骨骼肌成肌细胞可能为缺血性心肌病治疗的研究提供了新方向。

1.2 ESCs ESCs是从早期胚胎或原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。体内外环境中，ESCs能被诱导分化为机体所有的细胞类型。已有多项动物实验研究表明由ESCs分化的心肌细胞具有早期心肌细胞的结构与功能，在移植入心肌梗死区域后能够与宿主心肌细胞发生偶联，从而一定程度地改善心脏功能[4]。然而，由于移植的ESCs可能会导致肿瘤的发生，且作为异体细胞，移植后也可能产生免疫排斥反应；导致的心律失常和胚胎获取也颇受伦理争议，因此，严重影响ESCs的临床应用。

1.3 BMSCs BMSCs是一类存在于骨髓内具有自我复制和多向分化潜能的成体干细胞，在一定的诱导条件下，能向成骨、脂肪和成软骨等细胞方向分化，利用其贴壁生长、采集容易、无免疫排斥、可自体移植、无伦理争议等优点，已成为临床研究的主要干细胞。已有研究表明，向缺血性心肌病患者的受损心肌区域移植入BMSCs能够促进新血管生成，减轻心肌纤维化，从而改善心功能。也有报道指出粒细胞集落刺激因子(G-CSF)能够刺激BMSCs释放进入外周血。Kuhlmann等[5]研究发现，与单用BMSCs相比，实验组利用G-CSF刺激BMSCs治疗急性心肌梗死可以减少室性心律失常的发生，心肌梗死区域心肌上的Cx43也明显增高，达到维持在能够稳定心肌细胞正常传导速度的水平。也有研究发现，G-CSF刺激动员BMSCs还有促进心肌血管再生和减缓心肌缺血再灌注损伤的作用。BMSCs注射进缺血性心肌病患者体内，患者的NYHA心功能分级、生活质量和存活率显著增高，且缺血性心肌病患者(LVEF<50%)在经心内膜向心肌内注射BMSCs 30 d后，其心肌的梗死面积显著减少，心功能状态显著改善，证明移植BMSCs治疗缺血性心肌病和心功能不全不但安全，而且有效[6，7]。然而，BMSCs的作用机制目前尚未完全阐明。尽管BMSCs能否分化为心肌细胞还存在不同证据，但通过旁分泌作用，促进心肌血管生成和心肌细胞再生的作用机制日益清晰。

造血干细胞(HSCs)是来源于骨髓中具有自我更新和造血多谱系细胞分化潜能的干细胞，一般来源于骨髓、外周血和脐带血。人的HSCs主要表达CD33、CD34、C-Kit和CD133标志分子。由于HSCs是各种血细胞的前体细胞，临床采用HSCs移植治疗人类恶性血液病已是较为成熟的技术，也是治愈白血病等重要手段。已有研究发现，将小鼠HSCs与原代心肌细胞一起培养时，发现其能表达心肌细胞膜上的内向整流钾离子通道；从动物骨髓中分离出来的HSCs可以促进心肌血管再生和改善心功能[8]。近年的研究证明，HSCs是通过旁分泌途径改善急性心肌梗死后的心功能和抑制心室重建的作用，促进心肌血管再生、抑制心肌细胞凋亡、聚集心脏祖细胞和改变心肌细胞外基质成分等。

内皮祖细胞 (EPCs)是血管内皮细胞的前体细胞，在生理或病理因素的刺激下，可从骨髓动员到外周血中参与损伤血管的修复。主要存在于骨髓、外周血、胎儿肝脏和脐带血中，临床研究及应用中多采用骨髓和脐带血来源的EPCs。早在1997年日本学者Asahara就从外周血中分离出EPCs，证实了其可以在缺血组织和缺血器官中促进血管的生长。在创伤、局部组织缺血、血管损伤等条件刺激下，EPCs将会从骨髓和局部组织中动员，而产生新的血管。目前认为EPCs可能通过分化为血管内皮细胞和调控血管生长因子，从而促进心肌新血管再生修复受损心肌。已有研究发现通过向顽固性心绞痛患者心肌内注射EPCs治疗，显示患者的左心室功能、临床症状得到了明显改善，进而证明利用EPCs治疗顽固性心绞痛是安全有效的[9]。

1.4 羊膜干细胞 羊膜干细胞来源于产妇分娩后废弃的胎盘附属物，羊膜来源的干细胞主要包括人羊膜上皮细胞和人羊膜间充质干细胞，具有来源广泛、获取方便、无创采集、细胞量丰富及无论理争议等优点。人羊膜干细胞静脉或原位移植后，表现出低免疫原性，无明显排异反应和致瘤性，具有显著的抗炎作用，还可产生多种细胞生长因子，通过旁分泌作用促进损伤或坏死细胞的再生，在心肌组织的缺血损伤中具有良好的应用前景。结扎大鼠左冠状动脉前降支建立心肌梗死模型，1周后经心外膜移植2×106个BrdU标记的人羊膜上皮干细胞，结果发现，人羊膜上皮干细胞移植入心脏，明显改善急性心肌梗死大鼠心脏功能，减缓心室重构，促进心肌细胞再生及新生血管形成，减轻心肌缺血的作用[10]。

1.5 CSCs 传统观念认为，成年哺乳动物的心肌细胞是永久性细胞，已不具有完全修复损伤再生的作用。然而，近年的研究发现刚出生的胎儿和成熟心脏都具有一定的再生修复能力，心脏中的CSCs可分化为心肌细胞、内皮细胞、平滑肌细胞，从而修复受损的心肌组织，减少心肌梗死面积。根据CSCs表面标志物结合生物学特性将其分为六类：c-kit+、Sca-1+、SP、Isl-1+、SSEA-1+及心肌球衍生细胞(CDCs)。目前c-kit+细胞是临床研究最广泛及最具多能干细胞特征的一类细胞，具有克隆生长、自我更新及多向分化潜能等优点。Ellison等[11]通过观察敲除心衰小鼠CSCs后的心功能状态，发现小鼠的心脏将会终止再生及修复功能，当重新向心肌内注射入c-kit+CSCs后，小鼠心脏的受损部位将会得到修复，表明c-kit+CSCs在受损心脏的修复过程中起着重要的作用。利用CSCs治疗缺血性心肌病的Ⅰ期临床试验研究中，将心肌梗死后LVEF<40%的患者随机分为实验组和对照组，实验组经冠状动脉内注射自体CSCs，4个月后心脏磁共振成像检测显示，实验组心肌的梗死面积显著减少，MLHFQ评分明显增高[12]。经冠脉内注射CDCs后能够治疗患者的缺血性心肌病症状，实验将心肌梗死后2～4周的心衰患者(25%≤LVEF≤45%)随机分为实验组和对照组。实验组将自体CDCs输入心肌梗死区域， 6个月和12个月后，与对照组相比实验组的心肌梗死面积显著减少，心肌存活率和收缩力都显著增强，且无不良反应发生。由此说明，采用经冠脉内注射CDCs进行治疗缺血性心肌病的方法安全有效[13]。此外，近几年的研究表明干细胞来源的外泌体在干细胞发挥旁分泌作用[14]，外泌体可以通过抑制心肌细胞凋亡来减少心肌梗死面积；也可作用于内皮细胞，促进血管内皮细胞增生和转移；作用于中性粒细胞、巨噬细胞等炎性细胞，减缓心肌的炎症反应和氧化应激损伤，刺激CDCs分化为心肌细胞，从而改善缺血性心肌病患者的心功能。

2 干细胞治疗缺血性心脏病的作用机制

2.1 直接分化为功能细胞 研究发现，因干细胞具有多向分化潜能，在一定的诱导条件下可以分化为心肌细胞、内皮细胞及平滑肌细胞。在体内外实验研究中，均可以诱导BMSCs向心肌细胞分化，将BMSCs移植入心肌梗死区域后，它能表达心肌细胞表面标志物如肌钙蛋白T、α-肌动蛋白和连接蛋白等，也可表达平滑肌细胞和血管内皮细胞表面的特异性蛋白[15]，说明移植后的BMSCs分化为心肌细胞和血管内皮细胞后，既可减少心肌梗死面积，也可促进心肌再生和血管再生，从而显著改善缺血心肌的心脏功能。

2.2 促进血管再生 诸多研究表明，干细胞用于缺血性心肌病的治疗，能够促进心肌血管的生成，改善心肌的血供，减少心肌细胞的坏死，进而改善心功能。BMSCs能够促进血管内皮细胞有丝分裂、增生和迁移，从而实现心肌局部缺血组织的血管再生，进而改善心脏的功能。ESCs在缺氧条件下也能够分泌外泌体，从而促进胚胎中的微血管内皮细胞迁移及血管化。向心肌梗死小鼠的心肌内注射BMSCs来源的微泡能够显著改善梗死心肌的血流状况，促进血管内皮细胞的增生和迁移，促进心肌内微血管增生，抑制梗死区域心肌细胞凋亡，从而显著改善心肌的功能[16]，外周血、脾脏、脂肪等其他来源的干细胞研究中，也发现在促进血管再生过程中存在着相似的机制和效果。

2.3 旁分泌作用 干细胞旁分泌效应对心肌细胞的保护作用日益受到重视，外泌体作为干细胞旁分泌效应的代表性物质，已被作为一种新型替代疗法应用于治疗心血管疾病中。不同干细胞来源的外泌体可通过促进受体细胞存活、增殖、新生血管形成、改善心肌内侧支循环、改善心肌代谢、抑制心肌细胞凋亡、抑制心肌纤维化、改善心肌重构等多种方式，促进梗死心肌再生修复，提高心脏功能。在心肌的再灌注治疗中，可以明显减轻心肌的炎症反应及氧化应激损伤，从而抑制心肌细胞凋亡，减少心肌的梗死面积。MSCs还可通过产生一些造血细胞因子来发挥其生物学效应，如血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子-1、干细胞因子等。

2.4 免疫调节作用 间充质干细胞具有低免疫原性及免疫调节的作用，能够逃避免疫识别和抑制免疫应答,还能够通过对抗原提呈细胞、T细胞、NK细胞、B细胞等免疫细胞的影响而发挥免疫调节作用。已有研究发现，BMSCs诱导的免疫抑制反应不是直接的细胞效应，而是由调节免疫细胞释放到炎症微环境中的多种炎性细胞因子和抗炎因子介导，如INF-γ、TNF-α及IL-1α和β、IL-4、IL-10等。缺血性心肌病患者移植BMSCs后，心肌梗死面积显著减少，心脏功能不但有所改善，心肌组织中的炎症因子TNF-α、IL-1β等也显著减少。

尽管多个国家在积极开展干细胞治疗缺血性心肌病的临床研究与转化应用，目前也尚未观察到间充质干细胞移植后引起的严重不良反应，但仍缺乏大规模临床研究，其远期疗效与安全性尚无法预知。随着干细胞活体示踪、心肌存活与功能检测及评估新技术的诞生，干细胞移植治疗心肌梗死及心功能不全等疾病的临床应用也将会得到更大发展。选择适宜的干细胞类型，探索其在临床应用中的有效性和安全性，有望提高缺血性心肌病的治疗效果。

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