植物乳杆菌对仔猪肠道健康的影响

■崔艳红 韩庆功 王九峰 魏刚才 刘长忠

（1.中国农业大学动物医学院，北京100193；2.河南科技学院动物科技学院，河南新乡453003）

益生菌是能促进动物胃肠内（主要是肠道）菌群生态平衡的活性微生物，因其无毒、无残留、多功能、不污染环境等特点而日益受到青睐，是可作为抗生素替代品的一种新型环保饲料添加物。植物乳杆菌(Lactobacillus pluuturum，LP)是乳酸菌中的一种，属于乳杆菌科中的乳杆菌属，革兰氏阳性、无芽孢、厌氧或兼性厌氧菌，最适生长温度为30～35℃[1-2]，菌种为杆状，呈单个、有时成对或成链状排列，最适pH值6.5左右，属于同型发酵乳酸菌[3]。

1989年美国食品药物管理局(FDA)和美国饲料认定协会(AAFCO)将植物乳杆菌列入可直接饲喂的益生菌菌种目录。我国农业部自1999年第105号公告起，到2013年第2045号公告《饲料添加剂品种目录》，每次修订后的目录都将植物乳杆菌作为动物养殖的微生物添加剂之一。目前用作益生菌的乳酸菌主要来源于人和动物的肠道或粪便，当前乳酸菌被广泛应用在食品、饲料发酵和微生态制剂领域。作为人和动物肠道重要的益生菌群，在代谢过程中，乳酸菌能通过竞争性抑制作用在胃肠道内占位、定植，抑制致病菌对胃肠道侵害，改善肠道微生物多样性，调节肠道菌群平衡，提高机体免疫力和促进营养物质吸收等多种作用[4-11]。通常将乳酸菌的耐酸、耐胆盐和黏附定植能力等作为评价筛选潜在益生菌的重要标准。现就植物乳杆菌对胃肠道环境的适应能力、黏附特性、对胃肠道微生态的调节和肠黏膜形态的影响等方面进行综述。

1 植物乳杆菌对仔猪胃肠道环境的耐受力

植物乳杆菌对动物高胃酸环境和消化道内胆盐等形成的高渗环境的耐受力是评价其益生效果好坏的重要指标。对胃内pH值、肠道胆盐等的耐受性是保证益生菌在宿主体内存活和生长的前提，是其发挥益生作用的先决条件。新生仔猪胃内pH值通常在5.0～6.0之间，仔猪在断奶后1～2周pH值恢复到3.5左右[12]，但依然高于成年猪pH值2.0～3.5的水平，饲料在胃内的停留时间一般为2～4 h。肠道中胆盐的浓度一般在0.03%～0.3%的范围内[13]。

张飞燕等[14]从健康散养鸡的鸡粪便中分离得到的植物乳杆菌，在pH值2.0的条件下，存活率可达到86%以上，在胆盐浓度为0.3%时，存活率有所下降，为53.7%，但继续提高胆盐浓度到0.4%时，存活率仍可保持在36%以上。许女等[15]从西藏Kefir粒中分离获得植物乳杆菌MA2，菌株在培养基pH值为2的酸性环境中培养2 h后，活菌数下降了两个数量级，从108下降到106；在培养基中胆盐浓度为0.3%时，活菌数也下降了两个数量级，但当胆盐浓度提高到0.5%时，活菌数下降到105，只降低了3个数量级，表明植物乳杆菌MA2菌株具有良好的耐酸、耐胆盐特性。隋梦等[16]从发酵米粉中筛选出的植物乳杆菌Zhang-LL，菌株在pH值1.5～3.0的酸性环境中培养3 h，活菌数只下降了一个数量级，菌液浓度可达106CFU/ml；在胆盐浓度为0.10%～0.50%环境中培养8 h后，活菌数在105～107CFU/ml之间，表明获得的分离株具有较强的耐受胃肠道酸性和高渗环境的特性。在模拟人工胃液和肠液环境条件的试验中，发现植物乳杆菌N59-1在pH值为3的人工胃液中培养3 h后，存活率仍可达到为89%以上，再从胃液转移到肠液保持3 h后，N59-1的存活率仍大于80%[17]。

张艳萍等[18]以海藻酸钠和脱脂乳作为混合壁材对植物乳杆菌A409微囊化，微囊化后对酸性条件、胆盐质量分数、人工胃液和人工肠液均有较高的耐受性，稳定性良好。程福亮等[19]的研究表明，猪源植物乳杆菌诱变株BL-15耐酸性较好，其在酸性条件下存活菌落总数的对数值与对照组基本一致；在耐胆盐试验中，存活菌落总数与对照组中菌落总数的对数值相差小于2，表明对酸和胆盐耐受效果较好。孟祥晨等[20]的研究表明，两株植物乳杆菌在pH值3的PBS缓冲溶液中保持3 h，活菌数均超过9 log CFU/ml，在0.3%的胆盐浓度中孵育8 h和在1%的胆盐浓度中孵育4 h后，两株植物乳杆菌活菌数均维持在8 log CFU/ml，表明对低酸和高胆盐有较好的耐受力。不同来源的植物乳杆菌可以抵抗胃液较强的酸性环境和耐受动物消化道内胆盐等形成的高渗环境，顺利地到达仔猪肠道并存活，从而为发挥其益生功能奠定了基础。

2 植物乳杆菌的黏附及对致病菌的黏附抑制

黏附是益生菌定植于宿主肠道发挥生理作用的前提条件，是实现其益生功能的第一步[21-22]。通过竞争性占位，在宿主肠黏膜形成生物屏障，从而排斥或置换阻止病原菌的定植；黏附定植肠道的乳酸菌，在适宜的环境中迅速生长繁殖，同时产生大量的初级代谢或次级代谢产物（如有机酸、过氧化氢和细菌素等），这些产物有利于调节胃肠道微生物菌群结构的平衡的和激发宿主胃肠道免疫系统的发育[22-23]。有研究表明，乳杆菌的黏附具有较强的种属特异性和宿主特异性[22-23]。在体外评价和筛选益生菌时，其黏附定植能力是衡量益生菌活菌制剂效果的重要指标之一。

凌晨等[24]报道，乳酸菌可以黏附于仔猪肠上皮细胞且表现出剂量效应。乳酸菌与沙门菌或大肠埃希菌的黏附竞争，与对照组相比，致病菌的黏附能力受到抑制，并且对致病菌的黏附抑制率也呈现出剂量效应，高含量的乳酸菌对沙门菌、大肠埃希菌的排斥率均高达88%以上，置换率也均达到70%以上。但是，低含量的乳酸菌黏附排斥作用显著下降，同时自身黏附细胞的能力也显著下降，对沙门菌的置换在低剂量时效果较差，甚至出现负向效果，即不但没有发挥置换作用，反而增加了沙门菌对细胞的黏附率。张莉[25]在研究中发现，植物乳杆菌C88对氯仿的疏水性极强（＞80%），氯仿为单极、酸性溶剂，是电子受体，表明C88菌株是强电子供体，对二甲苯和乙酸乙酯也都有较强的疏水性，从而间接表明C88菌株可能具有较强的黏附肠上皮细胞的能力。乳酸菌对Caco-2细胞的黏附试验表明，菌株C88对Caco-2单层细胞的黏附率高于鼠李糖乳杆菌GG；在黏附竞争试验中，菌株C88对四种致病菌（大肠杆菌、葡萄球菌、沙门氏菌和福氏志贺氏菌）抑制率为22%～71%不等，对四种致病菌的排斥作用和置换作用也很强，除排斥试验中的沙门氏菌外，其他都达到了极显著的水平。有研究发现L.plantarumCS24.2能够抑制30%～90%肠致病性大肠杆菌（EPEC）和肠炎沙门氏菌血清型伤寒沙门氏菌在人体肠上皮细胞Caco-2的定植，Dhanani等[26-27]的研究发现植物乳杆菌黏附素EF-Tu在黏附肠道组织和抑制肠道病原体中发挥重要作用。Dhanani等[28]发现植物乳杆菌CS24.2能抑制大肠杆菌O26∶H11对HT-29细胞的黏附，在大肠杆菌感染HT-29细胞后，并下调了细胞中TNF-α和IL-8的基因表达。Ren等[29]发现植物乳杆菌能强烈抑制金黄色葡萄球菌对Caco-2细胞的黏附作用。

很多因素会影响乳酸菌黏附肠道上皮细胞，细菌自身因素如细菌生长时期、菌液浓度、乳酸菌细胞壁表面存在的壁磷壁酸、脂磷壁酸、肽聚糖、S层蛋白、相关表面蛋白和细胞分泌的胞外多糖等黏附素[30]；动物因素如肠道内pH值、温度和肠道黏液的组分等。研究表明，乳酸菌的黏附定植具有属种特异性和剂量效应，对病原菌的抑制效果也与剂量、代谢产物等因素有关，动物黏附效应已经被多数试验证明是益生菌抵抗致病菌的重要影响因子[31]，但具体的分子作用机制还不是很清楚。目前用于乳酸菌黏附特性评价的体外试验模型主要有细胞模型、肠黏液模型和组织器官模型三类，但这些模型各具优劣，能真实反映乳酸菌在宿主肠道黏附效果，统一标准的乳酸菌黏附机制评价模型尚未建立。另也有不同的报道，如有人给17名健康志愿者每天两次，连续服用18 d含6×109CFU的益生菌冻干粉A(L.plantarumMF1291，MF1298)和B(L.pentosusMF1300，L.salivariuDC5，L.plantarum DC13)，结果从粪便中不能监测到L.plantarumDC13,在清除期的第24 d和30 d，从粪便中也不能监测到L.plantarumMF1291和L.salivariuDC5[32]。因此益生菌在肠道中的黏附和定植是否是益生菌发挥生物活性的必须要素还需要进一步的证实。

3 乳酸菌对肠道微生物多样性的影响

在健康仔猪胃肠道微生物群落结构中，绝大多数的乳酸菌菌种对仔猪的健康是有益的，并且乳酸菌属厚壁菌门，是肠道最占优势的菌群之一；相反，肠杆菌科中很多菌种对动物是有害的，肠杆菌属变形菌门，一般是致病菌或者条件致病菌。因此，创造有利乳酸菌生长繁殖的条件，提高乳酸菌在肠道菌群中的丰度，减少致病菌的数量是保证仔猪肠道健康的关键。

益生菌可以提高肠道菌群的多样性，抑制致病菌的生长繁殖，从而实现维持肠道微生物群落的动态平衡[33]。已有研究表明，乳酸菌能选择性促进有益菌群的繁殖，提高肠道有益优势菌群所占比例，抑制有害微生物的生长，从而有效调节肠道菌群结构，Guerra-Ordaz等[4]报道，对断奶仔猪饲喂植物乳杆菌[2×1010CFU/(头·d)]8 d后，进行ETEC K88攻毒试验，在攻毒后第6 d和第10 d屠宰，评价植物乳杆菌控制断奶后仔猪大肠杆菌病的潜力，结果表明益生菌组显著增加了植物乳杆菌在回肠和结肠中的数量，在结肠中的总乳酸菌数量也显著增加，并显示出减少腹泻的趋势。饲喂植物杆菌发酵饲料有益于猪抗沙门氏菌感染，影响或减少猪粪中肠杆菌科的数量[8-9]。赵秀英等[10]研究报道，断奶前给仔猪饲喂植物乳杆菌和干酪乳杆菌，植物乳杆菌可显著提高断奶前回肠、结肠菌群多样性和提高肠道乳酸菌和双歧杆菌的数量。与断奶前相比，断奶后3 d三组菌群多样性都有所下降，表明肠道菌群的多样性易受断奶应激的影响，但植物乳杆菌组的菌群多样性依然显著高于其他组，表明植物乳杆菌能缓解断奶对菌群造成的影响，到断奶后2周时，植物乳杆菌组菌群多样性显著高于对照组，并可促进回肠、结肠乳酸菌和双歧杆菌的生长。Tajima等[6]报道，用植物乳杆菌发酵液体饲料喂仔猪，与对照组和抗生素组相比，可以提高仔猪回肠和盲肠中细菌的多样性，但三个处理组回肠中的大部分细菌序列属于乳酸菌，占总细菌序列的92%以上。在盲肠中，对照组和抗生素组仍是乳酸菌占主导地位，分别占59%和64%。但在液体发酵饲料组中乳酸菌占总细菌序列的比例下降至31%，但厚壁菌门中的Dorea属、粪球菌属、罗斯氏菌属和柔嫩梭菌丰度增加，胃肠道中的细菌多样性增强。Kobashi等[7]报道，饲喂植物乳杆菌发酵液体饲料，仔猪粪便中乳酸菌的数量由断奶时的8.77×108CFU/g DM，在断奶后第28天增加至1.23×1012CFU/g DM，表明饲喂发酵液体饲料可以增加肠道内乳酸菌的数量。几乎分离获得的大肠杆菌菌株在断奶后14 d内全部耐金霉素，在断奶后第28 d，发酵液体饲料组的耐金霉素的大肠杆菌菌株降低至22.2%，而对照组中的耐药菌比例为88.9%，显示饲喂发酵液体饲料会减少抗生素抗性细菌。

De Angelis等[34]报道，乳酸菌黏附和定植在肠道后，成为肠道正常菌群的成员，能够阻止肠道细菌移位和调节微生态平衡。Fuentes等[35]报道，口服活的植物乳杆菌或者复合益生菌制剂有效地抑制断奶仔猪肠道大肠杆菌数量，增加肠道有益菌如乳酸菌、双歧杆菌的多样性和数量，调节肠道菌群平衡。

4 乳酸菌对肠道组织形态结构的影响

单胃动物蛋白质的60%～70%是在小肠消化，因此小肠通常被认为是仔猪营养物质消化吸收的主要场所，通过营养调控手段，促进肠绒毛的发育和改善微绒毛结构，可以增加小肠内壁表面积，从而提高对营养素的吸收效率。绒毛之间的隐窝是绒毛新细胞的来源，当绒毛损伤脱落时，隐窝细胞会向绒毛顶移行，并形成新的肠绒毛，隐窝深度是衡量肠上皮细胞更新速度的指标，随着细胞成熟率的上升，隐窝逐渐变浅，并且细胞的分泌功能增强。绒毛高度与隐窝深度比值能综合反映小肠的功能状态，当肠黏膜受损时，则比值下降，表明动物的消化吸收功能下降[36-37]。

肠道是重要的营养吸收器官，肠绒毛高度、隐窝深度等都是衡量小肠消化吸收功能的重要指标。Gao等[37]的研究表明绒毛高度/隐窝深度能够综合反映小肠的功能状态，其比值的下降，表明黏膜受损、消化吸收功能下降。刘虎传等[38]研究结果表明，给断奶仔猪饲喂乳酸菌后，可显著提高28、35 d和42 d仔猪空肠和回肠绒毛的高度，显著降低35、42 d仔猪空肠和28、35 d回肠的隐窝深度，显著增加盲肠内容物中短链脂肪酸的含量，缓解了断奶应激对仔猪肠道内环境的影响。Guerra-Ordaz等[4]报道，断奶仔猪饲喂植物乳杆菌10 d后（2×1010CFU/d），回肠绒毛高度和杯状细胞数量增加，结肠消化道中氨的浓度降低，肠道内环境得到改善。Suo等[5]研究表明，断奶仔猪饲喂植物乳杆菌ZJ316 60 d后，提高了断奶仔猪十二指肠、空肠以及回肠的绒毛高度，明显促进了小肠绒毛的发育，从而有利于提高对营养物质的消化吸收，进而促进仔猪日增重和饲料转化率的提高。

县怡涵等[11]报道，仔猪从7日龄开始至24日龄隔日灌喂植物乳杆菌菌液，结果表明，能促进35日龄断奶仔猪空肠和回肠绒毛发育，增加了空肠绒毛的高度，显著提高回肠隐窝深度，有增加回肠绒毛高度，降低绒腺比的趋势。使用植物乳杆菌，能明显改善肠道黏膜的形态结构，促进肠上皮细胞的生长，增加绒毛长度/隐窝深度。另外，植物乳杆菌NCU116能促进肠上皮细胞中杯状细胞的增殖，并且提高黏蛋白的分泌量，增加肠道黏膜的完整性，有效增强了肠道上皮的屏障防御能力[39]。

5 小结

植物乳杆菌是动物肠道正常的有益菌群之一，是生产实践中选择制备益生菌制剂的常用菌种，具有调节肠道菌群平衡、抑制有害菌定植、增强肠黏膜免疫等作用，但其作用效果受菌株属种特异性、菌株剂量效应、动物个体生理差异等诸多因素影响，常导致研究应用中效果不确实。目前就乳酸菌的研究，主要集中在乳酸菌的益生功能和其代谢产物方面，但关于代谢产物对宿主的作用模式、如何调控宿主的基因表达及维持微生物区系稳定的分子机制等的研究还较少。益生菌的益生效应不仅是在肠道的黏附定植和对致病菌抑制，更重要的是如何改变肠道菌群的组成，使之与有害菌争夺营养物质，从而抑制致病菌的生长和对宿主形成免疫应答刺激。在今后的研究中，应在细胞和分子水平上探讨就菌株发挥作用的有效成分、养分吸收转运、黏附抑制和刺激肠黏膜免疫的机制。

肠道微生态的平衡是一个复杂的过程，涉及到宿主和微生物间及微生物和微生物间复杂的调控反应，饲料营养水平、消化道内环境、宿主免疫系统、抗生素的使用和仔猪哺乳断奶情况等宿主因素均会影响肠道微生物组成与分布。利用分子生物学手段，不断深入探讨肠道生态系统和宿主间的关系，通过膳食纤维、短链脂肪酸、菌群代谢产物等营养手段调节肠道菌群结构，进而调节影响宿主代谢状态，配合微生物基因组技术阐明微生物菌群关键成员发挥作用的分子机制，证明肠道菌群的改变与发生炎症性疾病、肝病、肥胖和肠癌等肠道疾病之间的关系，将为促进动物机体健康、预防和治疗疾病提供理论基础，随着对乳酸菌研究的不断深入，将会出现更多的功能性添加剂产品，并在未来的应用中发挥重要的作用。