真菌微生物组在慢性呼吸道疾病发生发展中的作用

苏晓芳 董航明 蔡绍曦

南方医科大学南方医院呼吸与危重症医学科，慢性气道疾病实验室（广州 510515）

众所周知，感染是许多慢性呼吸道疾病急性发作的重要因素，其中细菌感染占绝大多数［1］，部分与病毒性感染有关［2］。由于传统培养技术是利用特定的培养基只能培养特定以及常见的病原体，使我们对呼吸道微生物的认识非常局限。过去的数十年里，人们一直认为健康人的下呼吸道是无菌的，且认为慢性呼吸道疾病（chronic respiratory disease，CRD）的急性发作主要是致病菌所致。随着高通量测序技术的发展，尤其是二代测序技术在微生物组学研究的应用，发现健康人下呼吸道同样存在微生物菌群，并且提出了真菌菌群平衡与失调的观念。认为人类健康与疾病也同真菌菌群的动态变化密切相关［3］，而不仅仅是常见几种包括流感嗜血杆菌、莫拉氏菌、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌等病原菌［4］导致急性发作及病情进展。目前许多呼吸道微生物组学研究主要集中在细菌菌群，而对于真菌菌群以及病毒的研究都较为缺乏，尤其是真菌微生物组与CRD的相关研究。本文就真菌微生物组与慢性呼吸道疾病的关系及微生态平衡与失调、二代测序在真菌微生物组学中的应用做一综述。

1 呼吸道真菌微生物组与慢性呼吸道疾病

真菌及真菌孢子可存在于人类的皮肤、黏膜、口腔、消化道、肺部等［5］，一些直径＜2～3μm的真菌以及真菌孢子可被吸入至终末支气管甚至是肺泡内。而真菌病原学特性与人体局部免疫反应则决定着这些微生物是附着/定植于或被清除出呼吸道，进而导致疾病的发生及进展［6-7］。真菌感染是威胁人类健康的一大疾病，尤其是肺部真菌感染，致死性高，严重威胁公共健康及患者生命。但是，真菌感染的诊治有时却让人束手无策，目前最常见且临床上能培养到的仍是念珠菌以及曲霉菌两大类［8］。同时，已有研究不仅表明了真菌与CRD之间的关系，还发现呼吸道真菌与CRD预后有关，也可导致肺功能的减退［9］。更有研究发现使用广谱抗生素影响真菌与细菌之间微生态平衡，导致呼吸道真菌感染的发生以及病原体对抗真菌药产生耐药［10］。临床上面临的种种挑战，让我们迫切需要一种新方法更准确、快速地辅助临床诊疗。虽然传统培养方法是真菌感染一种重要的诊断方法，但是它在鉴别混合感染以及分析菌群群落结构和动态变化非常有限。据我们所知，基于常规的培养方法，很多真菌或者未被发现的新菌种，很难甚至无法被培养出来［11］。二代测序技术无论从检测深度及广度，亦或分析菌群群落结构特征，明显优于培养技术。目前使用二代测序研究肺部真菌与CRD的关系并不多，过去的研究报道主要见于囊性纤维化（cystic fibrosis，CF）、哮喘以及慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive disease，COPD）等。有些研究也发现在健康人的下呼吸道可检测到少量的真菌微生物存在，主要是一些条件致病菌如曲霉菌和枝孢菌属；同时也发现健康人下呼吸道真菌微生物组与上呼吸道的有差别，如口咽部真菌菌群是以念珠菌属为主［12］。

对于CRD患者呼吸道真菌菌群也明显与健康人的不同，其中研究最多的是CF患者。利用培养技术很容易检测到CF呼吸道定植真菌菌群，超过50%患者可找到曲霉菌及念珠菌［13］；但是它们在CF病情进展过程所起的作用存在争议。有些研究发现，CF患者呼吸道真菌负荷量增加而菌群α多样性是减少的，真菌可导致肺功能减退，这可能与疾病的严重程度相关，其中念珠菌属与曲霉菌属更是与CF的发病率密切相关［14］。近年来，少数研究利用二代测序技术，可检测到更为丰富的真菌菌群。据统计，利用454FLX方法检测到的真菌菌群，超过60%的种属是培养技术无法检测到［14］。即使目前各个研究结果有所差异，但共同一致的是念珠菌属丰度是最高的［14-15］。真菌可导致肺功能减退，影响疾病预后，而测序技术有助于从群落整体结构了解气道微生物的全貌以进一步辅助疾病的诊疗。

同样地，研究也发现真菌与哮喘的严重程度关系密切［12］，重症哮喘患者相对于轻度者、哮喘患者相对于健康人群、使用激素者相对于未使用激素者，呼吸道真菌负荷量增多［16］，其中曲霉菌的相对丰度最高。哮喘患者痰液中马拉色菌属，Psathyrella candolleana，Termitomyces clypeatus和Grifola sordulenta菌群丰度比健康对照组的高；而Eremothecium sinecaudum，Systenostrema alba，Cladosporium cladosporioides和Vanderwaltozyma polyspora在健康对照组更为常见［12］。事实上，除了曲霉菌可引起变态反应性疾病如哮喘、ABPA等［16］，有些真菌如马拉色菌属也被认为跟一些变态反应性疾病相关，如特发性皮炎和慢性鼻窦炎［18-19］。甚至也有研究发现肠道菌群可加重肺部炎症，引起肺部变态反应性疾病［19-20］，如肠道念珠菌可在肠道产生PEG2酶到达肺部引起炎症反应［21］。目前对于真菌与哮喘之间的关系以描述性研究为主，而呼吸道真菌在哮喘的急性发作及发病机制等方面的研究仍处于初始阶段，有待于深入探讨。

真菌微生物组学研究在COPD上较为少见。2015年有一项队列研究［22］，采集了56个研究对象（HIV、HIV合并COPD患者以及非HIV人群）的诱导痰（induced sputa，IS）、口腔灌洗液（oral washes，OW）以及肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavages，BAL）。研究发现，在HIV合并COPD患者，肺孢子菌异常高表达。同时也发现念珠菌属在OW标本中更为丰富，而Ceriporia lacerata、Saccharomyces cerevisiae以及Penicillium brevicompactum则在BAL标本中更为常见。并且研究表明HIV合并COPD与HIV肺功能正常者菌群结构有所差异。在HIV合并COPD人群中，BAL中可发现12种真菌的丰度更高（Sebacina incrustans，Junghuhnia nitida，Pneumocystis jirovecii等），而Bullera setariae和Trametes hirsuta在HIV肺功能正常者菌群丰度较高。现真菌微生物组学在COPD患者的研究比较缺乏，2015年该项队列研究主要还是以HIV患者为研究对象，并没有纳入COPD非HIV患者。因此，真菌微生物组与COPD急性发作及疾病进展的关系需要做进一步研究。同时COPD患者用药（如吸入激素、支气管扩张剂、抗生素等）对呼吸道真菌群落的影响还未明确，该方面研究尚缺乏但临床意义重大，值得进一步探索。

2 肠道真菌微生物组与慢性呼吸道疾病

肠道菌群与肠道外疾病的关联研究越来越多，包括肺部疾病如哮喘、神经精神疾病如帕金森病、糖尿病、高血压病、肥胖等［23］；近些年提出了肠-肺轴，讲述了肠道菌群与呼吸道菌群的相互作用［24］以及对疾病的影响。而肠道真菌菌群与肺部疾病的相关研究目前也不乏少数。早期提出的卫生学假说，认为婴幼儿期对微生物病原体的接触减少后，此后过敏性疾病的发病率将大大增高［25］。有研究表明在抗生素治疗后或无菌小鼠模型上，过敏性疾病发病率增加，且发现与缺乏微生物免疫相关的Th2有所关联［25］。但现在更多的研究是，关于肠道微生态平衡与失调跟疾病的关系，如炎症性肠病［27］、肠易激综合征、哮喘、CF等。如肠道菌群失调可增加呼吸道过敏性疾病的急性发作次数，尤其是念珠菌属减少而曲霉菌属、Wallemia及Epicoccum增加［20］。也有研究发现，在新生儿期肠道念珠菌和Rodotorula与哮喘的发病率增加相关，但是该机制尚未明确［27］。实际上也有研究利用哮喘模型小鼠，抗真菌治疗后肠道真菌菌群变异或者念珠菌属移植肠道后，可加重呼吸道炎症反应［19-20］；同时伴随着嗜酸细胞、肥大细胞、IL-3、IL-5、IFNγ以及IgE水平增高［19］。其中一项研究表明，肠道念珠菌通过产生一种PEG2酶作用于肺部后影响巨噬细胞导致呼吸道过敏性疾病的急性发作及加重［21］。其实，肠道菌群通常也反映口腔菌群菌落结构，而同时口腔菌群又直接影响呼吸道菌群，也与宿主微生物免疫相关。因此，口腔菌群、呼吸道菌群以及肠道菌群相互影响、相互作用，三者的研究都不可或缺。综上所述，肠道真菌菌群与呼吸道疾病的发生发展也有关联，但其机制尚未明确，还需深入研究。

3 真菌菌群微生态平衡与失调

真菌在我们的生存环境中是无处不在的，它在物种进化史扮演着重要的角色［28］，与人类有着千丝万缕的联系，对机体免疫系统有着巨大影响［29］，而免疫系统则维持着细菌、真菌与宿主之间的互利共生、共同进化的平衡关系。微生态失调首先在肠道细菌菌群上提出的，甚至认为可能是一些疾病的病因。但现在更多地认可真菌菌群失调在人类疾病发生发展过程中也起着重要的作用。它有别于真菌感染［30］，可以说是真菌感染的诱因，也是真菌感染的结果，它描述的是真菌菌群的整体结构特征。而我们的免疫系统则可识别共生真菌及致病真菌［3］，形成了一道天然的黏膜免疫屏障抵御真菌感染［31］。酵母科下的酵母属和念珠菌属、曲霉菌属、镰孢属、枝孢属以及马拉色菌属归于共生真菌，它们在一定条件下可导致疾病的发生，甚至在免疫功能缺陷者可引起菌血症。其中一些共生真菌参与维持机体免疫稳态，如布拉酵母菌，则可预防广谱抗生素使用后艰难梭菌的感染以及减轻腹泻症状［32］。其机制是酵母菌可产生蛋白酶和磷酸酶，从而使艰难梭菌和大肠杆菌产生的毒素失活，而且它可限制白色念珠菌和沙门氏菌［33］。因此，除外真菌感染，还有真菌失调在我们临床诊治上也同样有着重要的作用，需要临床医护人员以及研究者的关注以及进一步探索。

4 二代测序与真菌微生物组学研究

二代测序技术在微生物组学应用越来越广泛，测序技术主要包括了宏基因组学和菌群结构谱。其中，真菌菌群结构谱方法主要是通过对真菌ITS1（internal transcribed spacer）和ITS2基因片段进行扩增、测序、分析，也可以称作ITS1/ITS2基因测序技术。

真菌不同于细菌的结构特征是真菌有一层厚厚的细胞壁，因此，细菌DNA提取方法并不一定适用于真菌。真菌有自己独特的DNA提取和PCR扩增的方法，而且不同的真菌DNA检测方法可能会产生不一样的结果。虽然，全基因组测序鸟枪法产生偏差最小，但它所要求的测序深度要绝对足够完成全部测序序列的检测。利用该方法检测人类粪便标本时，只能检测识别到5种真菌，包含6.5×1011碱基［34］。而利用真菌特异性检测方法，如ITS1/ITS2基因测序，可检测到50～60个菌属［35］。该真菌特异性检测方法是对真菌rDNA的ITS1/ITS2基因进行扩增并测序分析。因为不同的PCR引物可以靶向不同的真菌ITS基因，所以它可以更好地对真菌菌群进行分类。而且测序所得到的真菌ITS基因序列可以通过现有的基因数据库进行匹对，但对于新物种，则无法准确地确定种类［36］。在Gene-Bank平台上，还有许多真菌ITS测序序列被定义为“unidentified fungus”。还有一点需要说明的是，对于不同菌属，ITS基因测序方法的识别度会有所差异。对于念珠菌属以及曲霉菌属，ITS基因测序可以很好地识别它们的ITS基因序列，并且可在种水平区分出一些病原菌菌株［37］。而对于有些菌属如Cladosporium（枝孢属）则无法更好地分类出其在种水平的菌株。因此，应根据研究设计、研究对象以及研究目的，权衡利弊，选择适合的真菌检测方法。

5 总结

真菌在我们的生存环境是无处不在的，与人类健康和疾病状态息息相关。真菌菌群的动态平衡则对于维持免疫稳态起着重要作用，并形成一道天然的黏膜免疫屏障保护机体。真菌存在于皮肤、口腔、肠道、呼吸道等部位，一部分真菌在一定条件下可致病，甚至导致菌血症。而真菌微生物组学在呼吸道疾病研究比较少，未来仍有很大探索空间。近年来，二代测序技术的发展，使呼吸道微生物组学研究成为一个焦点并且研究内容更为丰富和深入，为我们提供更为广阔的研究视野以及研究前景，并在未来可能成为指导我们临床疾病的诊治的重要手段。

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