膝骨关节炎再生修复治疗新方法研究进展

张中原 余丽梅 ，3 王信

遵义医学院附属医院1贵州省细胞工程重点实验室，2贵州省组织损伤修复与再生医学2011协同创新中心，3贵州省骨髓与羊膜间充质干细胞基础与临床研究科技创新人才团队，4骨科（贵州遵义563003）

膝骨关节炎（keen osteoarthritis，KOA）是最常见的关节疾病，发病率随着年龄的增长而显著增加。据统计，全球60岁以上人群中发病率男性约占10%，女性约占18%，约80%的KOA患者行动受限，其中25%可导致残疾［1］。已明确的KOA风险因素包括年龄、性别、创伤、肥胖、代谢功能障碍、环境和遗传因素等，所致病理学改变为膝骨关节退行性变，特征改变是膝关节软骨细胞功能减退和数量减少、软骨基质减少。关节软骨组织中唯一的软骨细胞占关节软骨体积的1%～5%，可分泌Ⅱ型胶原蛋白、蛋白聚糖和透明质酸等重要组分，并负责维持细胞外基质代谢平衡。研究已经证实TGF-β/Smad、Wnt/β-catenin、Notch、Indian hedgehog通路及一些炎症因子均可刺激软骨细胞肥大导致KOA的发生；且上述信号通路涉及破坏软骨细胞合成和分解代谢平衡的多个共同靶基因，如Runx2、Mmp13和Adamts5等，并终致基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）和带有血小板凝血酶敏感蛋白样模体的解整链蛋白金属蛋白酶（聚蛋白多/聚糖酶，a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTS）上调，Ⅱ型胶原和蛋白聚糖合成减少而降解软骨基质；炎症免疫可促发或加剧软骨的病理改变［2］。然而，由于关节软骨自身没有营养血管、淋巴管及神经存在，导致其自身修复能力也十分有限。

目前针对轻中度KOA患者的临床症状，主要采用非手术治疗，给予抗炎、镇痛药或补充硫酸软骨素，局部注射透明质酸钠、理疗或中医药结合治疗，这些措施可暂时缓解KOA的临床症状或一定程度地阻滞病情进展，但很难完全修复受损的膝关节软骨；中重度患者，则只能依靠马赛克整形、软骨下骨钻孔、软骨清理成形等手术干预，50岁以下的年轻患者虽有较好疗效，但个体差异较大，膝关节修复面积有限，难以解决软骨进行性损伤的根本问题，最终，只能选择全关节置换手术，因此，一直以来KOA中损伤关节的完美修复一直是人们努力追求的理想方案。随着人们对KOA发病机制、组织工程生物材料和种子细胞生物学特性和功能认识的深入，生长因子、血液成分提取物、干细胞或软骨细胞移植、干细胞来源外泌体及基因治疗等新方法越来越多地显示了良好的KOA治疗应用前景。

1 生长因子（growth factor，GF）

对KOA治疗而言，所用GF主要为维持软骨和骨骼稳态及其再生修复中产生重要作用的细胞因子，具有刺激软骨细胞再生的作用，可促进软骨细胞合成代谢与软骨基质分泌，转化生长因子超家族，特别是骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein）BMP-2和BMP-7、成纤维细胞生长因子和成纤维细胞生长因子-18及胰岛素样生长因子-1、软骨素等在软骨和骨损伤修复中效果尤为显著［3-4］。它们不但在软骨和骨骼组织中表达，还通过调节炎症、免疫、成纤维化细胞、软骨细胞和成骨细胞功能，及多种信号通路相互串扰，调节膝关节局部组织细胞的多个分解和合成代谢过程，而发挥治疗作用［5］，其治疗效果也取决于这些GF的内源性水平、使用剂量、关节腔内环境、配合应用的生物支架材料及关节局部的生物力学完整性等［3］。虽然上述GF的再生潜力已在不同程度的创伤或退行性变所致KOA动物的治疗学研究中被确证，但尚缺乏规范、完整的人体临床试验，单一GF或多种GF联合应用的疗效差异也不尽相同。

2 血液成分提取物（blood composition extrction）

最近的研究表明，血液成分提取物不但具有减轻关节局部炎症反应的作用，也可较好地恢复膝关节再生修复的局部微环境，生物安全较好，制取方便，可通过微创局部给予。自体血液成分提取物所提供的多种生物活性分子可以实现膝关节软骨和骨组织局部自我平衡的恢复及退化组织的再生。20世纪90年代中期首个血液成分提取物——自体血清（autologous serum，ALS）应用于临床，ALS含有丰富的内源性IL-1受体拮抗剂，可很好地阻断IL-1β的作用，而IL-1β是KOA发病机制中最重要的炎症免疫反应介质之一。ALS膝关节局部注射治疗KOA的随机、双盲、对照试验表明，ALS的疗效明显优于透明质酸局部注射［6］，在Kellgren-Lawrence评分2～3级和晚期KOA患者的治疗中，ALS还可能通过降低炎症因子水平而产生抗炎效应，但ALS对骨代谢的影响尚不清楚［7］。近年使用的富血小板血浆（platelet rich plasma，PRP）微创注射治疗KOA的显著疗效也备受关注，多种生长因子储存在血小板α颗粒中，可明显改善关节软骨的合成代谢，是PRP发挥治疗作用的重要基础［8］。但这种疗法效果持续的时间有限，约6～12个月，且不能支持受损关节软骨的再生，PRP结合膝关节软骨再生种子细胞的策略，可能是解决这一难题的新思路，PRP生物学活性和功能的全面了解也对进一步合理开发KOA治疗应用具有重要意义。

3 间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）与软骨细胞

近20多年来，MSCs在KOA治疗中显示了良好的促进软骨组织再生修复、上调软骨细胞分泌功能的突出作用优势，MSCs通过直接的细胞间相互作用或分泌生物活性分子的间接作用，显著改善局部微环境，发挥营养、免疫调节和抗炎等多种生物学活性，已逐渐成为治疗KOA最具吸引力的新方法，局部应用MSCs后，其强大的分泌功能及分泌外泌体中所包含的miRNA、多种GF、抗炎因子等，也是MSCs促进软骨组织再生，改善关节组织细胞外基质条件，恢复软骨下骨微循环的重要始动因素，MSCs输注经体循环还可能补充了机体不足的MSCs池［9］。

体外扩增的骨髓来源MSCs或富集的非扩增骨髓来源干细胞均对KOA产生相似的满意治疗效果，主要表现为运动功能和关节、滑膜的OARSI评分恢复，以及软骨基质中Ⅱ型胶原和蛋白聚糖合成增多等组织病理学的改善，可能涉及MSCs抑制TGF-β/Smad，Wnt/β-catenin等信号通路，导致下游靶基因MMPs和ADAMTS表达下调，从而软骨基质中Ⅱ型胶原和蛋白聚糖合成增多，骨髓MSCs对IL-1、IL-6和TNF-α等炎性介质的明显抑制作用也在减轻关节软骨损伤方面起了重要作用［10-11］。

皮下脂肪组织来源的脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）由于采简单、侵入性较低，对KOA的治疗也受到关注。体外扩增的ADSCs或仅通过抽吸、离心等富集的基质血管部分（stromal vascular fraction，SVF）即含有包括ADSCs在内的不同细胞类型，在关节镜手术下注射至关节腔内，均可通过软骨再生而治疗局灶性大面积软骨病变［12］；也有研究报道，骨髓MSCs的体外软骨形成潜能明显高于ADSCs［13］；而膝关节外科手术中，易获取的髌下膝关节Hoffa脂肪垫也被认为是MSCs的另一理想来源，具有更高的软骨分化潜能［14］。粒细胞集落刺激因子刺激后的外周血应用于KOA治疗也具有很好的可行性，外周血中含有相当数量的包括MSCs、HSCs在内的干祖细胞［15］。新近的一项临床试验中，在关节镜下，软骨下钻孔和关节内注射自体外周血MSC结合透明质酸治疗全层软骨损伤，产生了十分明显的软骨再生、修复［16］。虽然采集技术还比较困难，但是扩增的滑膜组织来源的MSC也被认为是膝关节软骨修复的另一选择，关节镜清理术后，可将这种MSCs直接注射到损伤部位，也显示了可观的治疗效果［17］。肌源性干细胞也是软骨修复的潜在种子细胞，裸鼠的KOA模型中，运用逆转录病毒转导编码BMP-4和sFlt1（血管内皮生长因子-VEGF拮抗剂）基因的肌源性干细胞结合PRP治疗，产生了令人鼓舞的显著疗效［18］。脐带MSCs治疗KOA已成为首个国外上市的脐带MSCs制剂，在韩国进行的脐带MSCs干细胞和透明质酸钠治疗关节软骨缺损的Ⅱ期临床试验显示，关节的软骨损伤得到了良好的修复，且KOA治疗的有效性和安全性已在72个月的随访研究中进一步得到了证实［19］。

体外培养的自体软骨细胞和自体软骨片在临床治疗KOA中，已取得满意的疗效，但因创伤性取材及可获取软骨细胞数量极其有限，使其临床应用受到较大限制。荷兰正在进行的Ⅱ期临床试验中，采用纤维蛋白胶结合同种异体骨髓MSCs和带周围基质的自体软骨细胞，用于治疗局灶关节软骨缺损也取得了明显的治疗效果，且疗效由于自体软骨细胞移植［20］；与植入自体软骨细胞相比，基质诱导的自体MSCs植入显示出更早的临床症状改善［21］。

4 MSCs来源的外泌体（stem cell-derived exosomes）

MSCs分泌的外泌体（exosomes）也具有治疗KOA的作用。外泌体是细胞间的一种高效通讯载体，主要传递生物活性核酸（mRNA和microRNA）、蛋白质及脂质［22］。骨髓来源MSCs所分泌的外泌体治疗胶原酶诱导的KOA效果可观［23］，而诱导多能干细胞来源的外泌体治疗KOA的效果优于滑膜MSCs来源的外泌体［24］。外泌体的作用机制主要涉及相关microRNA的调节作用，microRNA与其靶基因转录的mRNA特异性结合，沉默表达的靶基因，或形成多个信号的相互作用网络。目前的研究主要集中于microRNA在KOA发病中的作用机制及对骨和软骨形成的调控［25］，而关于干细胞来源外泌体分泌miRNA参与KOA修复治疗的机制尚不清楚。沉默microRNA-34a可有效降低骨性关节炎中软骨细胞凋亡［26］。本课题组最近的研究已显示羊膜和脐带MSCs及二者来源的外泌体均对大鼠KOA具有显著的治疗效果，且羊膜MSCs可明显改变KOA鼠关节液中的众多miRNA表达水平，尤其是一些参与炎症反应调节的关键miRNA及其靶向沉默的多个炎症因子及基质金属蛋白酶等［27］。因此深入探讨MSCs来源外泌体治疗KOA的作用机制，可能对开发MSCs来源外泌体的临床应用具有重要意义。

5 基因治疗

通过基因工程技术，转导一些编码软骨细胞生长的重要细胞因子，而促进软骨再生，或转导抗炎因子，减轻炎症反应，产生持续的KOA治疗作用，也是一种颇有应用前景的KOA基因治疗方案。应用同种异体软骨细胞基因工程产生TGF-β1，将这种基因修饰的细胞植入关节内治疗严重的晚期KOA的Ⅰ和Ⅱ试验，已表明关节功能和临床症状得到显著改善［28-29］。一项随机双盲、多中心、安慰剂对照Ⅲ期临床试验随访1年后，也发现单次给予逆转录病毒转导TGF-β1软骨细胞后，KOA症状得到持久、显着的改善［30］；其他的相似研究也不断证明，基因治疗KOA具有非常良好的应用前景。

6 展望

尽管生物治疗方法在缓解KOA症状和软骨修复再生展现出理想的疗效，但由于KOA的病因及发病机制尚不明朗，在软骨修复再生质量和长期稳定疗效以及明确的治疗机制方面还需进行大量针对性的研究。而联合应用多种生物治疗方法，可能会更为有效的减轻KOA损伤和更好地再生修复。在未来这应该是主要的研究方向，在不久的将来生物治疗方式可能会是临床KOA的主要治疗方式。

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