OPG/RANKLlRANK信号通路在骨质疏松症患者骨重建中作用机制的研究进展

谭敏，杨颜瑜，熊琴，张全波

(1川北医学院，四川南充637000；2川北医学院附属医院)

骨质疏松症(OP)是最常见的骨代谢性疾病，主要特征为骨密度降低、骨微结构破坏、骨强度下降、骨折风险增高。OP可分为原发性和继发性两型，绝经后OP和老年性OP是常见的原发性OP，又被称为退行性OP。研究[1]发现，OP的发病与年龄有关。中国人口老龄化日趋明显[2],人口老龄化将导致OP发病病进一步上升。骨的生长发育、成熟后骨的维持与修复以及骨组织中钙离子的输出均依赖于一个动态过程，即骨重建。正常生理环境下，破骨细胞介导的骨吸收和成骨细胞街道的的骨形成保持在一个平衡状态，以维持骨骼系统的稳态[3]。骨吸收和骨形成之间的平衡紊乱将会导致疾病的发生，如骨吸收大于骨形成时将导致骨质疏松或骨质破坏。破骨细胞和成骨细胞间的活动受成骨细胞和破骨细胞之间的直接作用、骨代谢的神经内分泌系统以及免疫系统和骨细胞的局部相互作用三个途径的调控。当骨吸收和骨形成的平衡紊乱时可导致骨质疏松症的产生。成骨细胞、骨髓基质细胞、激活的T淋巴细胞表达RANKL，与破骨细胞前体细胞或成熟破骨细胞表面上的RANK结合后，促进破骨细胞的分化及骨吸收活性。成骨细胞及骨髓基质细胞分泌表达OPG，而TNF-TNFR超家族蛋白核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)和核因子-κB受体活化因子(RANK)是涉及破骨细胞发育和骨重建的关键因素，它们在介导骨稳态以及骨破坏中具有重要作用[4]。RANKL与其受体RANK的结合促进破骨细胞的生存、增殖、分化、活化。骨保护素(OPG)被认为是防止骨流失的保护因子，其作为RANKL的诱饵受体，通过与RANKL结合并阻止RANK信号传导而起到诱饵受体的作用。现将OPG/RANKL/RANK信号通路在调控骨重建三个途径？的作用机制综述如下。

1 OPG/RANKL/RANK信号通路的作用

OPG也被称为破骨细胞生成抑制因子(OCIF),是一种可溶性肿瘤坏死因子受体超家族成员，其分别与RANKL和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)相结合，发挥生物学作用，并具有与CD40相似的结构域，因此，它能够与CD40配体结合，介导免疫相关作用。OPG在成骨细胞中的表达受激素、细胞因子和生长因子(如雌激素，1,25(OH)2D3和肿瘤坏死因子)的调节。骨转换过程中OPG可作为RANKL的假受体，没有受体活性，其与RANKL结合后，能阻断RANKL/RANK信号通路，从而抑制破骨细胞分化与成熟。最新研究[5]表明，OPG可通过自噬相关基因和AMPK/mTOR/p70S6K信号传导抑制破骨细胞分化和骨吸收。

RANKL是核因子肿瘤坏死因子超家族成员，其在包括骨、骨髓以及淋巴组织在内的许多组织中表达，主要表达于巨噬细胞、成纤维细胞、成骨细胞、活化的T淋巴细胞等。维生素D3、甲状旁腺激素和炎性细胞因子等破骨细胞生成因子均可调节RANKL表达。当成骨细胞活化时，RANKL表达上调，通过与RANK结合，刺激破骨细胞分化，调节破骨细胞功能，间接调节骨量。Tsukasaki等[6]通过体外及体外实验表明，RANKL是目前诱导破骨细胞分化的最重要的分子。

RANK是RANKL的信号受体，属于肿瘤坏死因子受体家族，含有616个氨基酸同源跨膜蛋白。RANK主要表达于单核-巨噬细胞系。骨骼系统中RANK主要表达于破骨细胞前体细胞和成熟的破骨细胞表面表达，它是RANKL发挥促破骨细胞分化作用的唯一已知受体，RANKL与RANK结合，RANK信号通路活化，能维持破骨细胞活性，抑制破骨细胞凋亡，刺激成骨细胞生长[7]。

2 OPG/RANKL/RANK信号通路在成骨细胞、破骨细胞分化及活化中的调控作用机制

RANK通过激活其下游的信号传导通路使破骨细胞表达相应的特异性基因，以促进破骨细胞的分化、活化，抑制破骨细胞的凋亡。由于RANK胞质结构域中没有内在酶活性,因此，RANK通过招募如肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAFs)等对接蛋白来启动转导细胞内信号。TRAF2、TRAF5、TRAF6可与RANK的胞质结构域中的特定位点结合并激活下游分子，其中TRAF6是破骨细胞分化最为关键的结合位点[8]，相反，TRAF3负向调节破骨细胞分化[9]。

在RANK信号传导的起始阶段，RANK与RANKL结合导致对接蛋白TRAFs募集至RNAK的三聚化细胞质尾部(TRAFs依赖性基序1、2、3)并快速激活下游多条信号通路，其中最主要的是激活NF-κB通路,抗凋亡丝氨酸/苏氨酸激酶Akt/PKB通路及丝裂原活化蛋白激酶MAPK(MAPK)通路[10]。转化生长因子β激活性激酶1(TAK1)通过介导NF-κB和MAPKs通路在RANK信号传导通路中发挥重要作用。RANK在RANKL刺激下，其胞质部分与TRAFs结合，并与TAK1结合蛋白(TABs)组成复合物，共同激活TAK1。在TAK1缺陷的巨噬细胞中，RANKL诱导的NF-κB和MAPK通路的JNK的活化均被抑制[11]。各种信号通路激活的精确信号机制尚未完全阐明，其主要参与的信号通路包括：NF-κB通路NF-κB家族的转录因子由五个成员组成(p50,p52,RelA,RelB和c-Rel)，其激活主要通过经典途径和非经典途径。在经典途径中，TAK1激活由IκB激酶(IKK)复合物，IKK复合物由IKKα、IKKβ和NEMO组成，激活的IKK复合物促进NF-κB抑制物(IκB)磷酸化，使其从NF-κB上脱落，并被泛素化、降解，使NF-κB由抑制状态被激活，导致NF-κB的P50/RelA二聚体入核，促进靶基因的表达和转录从而使前体细胞分化为破骨细胞。非经典途径中，IKK复合物为IKKα/IKKα，其由NF-kB诱导激酶(NIK)激活，使NF-κB的P52/RelB二聚体入核并激活靶标基因。MAPK通路主要包括c-Jun氨基末端激酶(JNK)、细胞外信号调节激酶(ERK)和p38三条通路。RANK/TRAF6/TABs/TAK1复合物通过活化不同的蛋白激酶，如MKK4/MKK7、MEK1/MEK2、MKK3/MKK6，而相应激活JNK、ERK和p38，促进细胞表达相关转录因子。JNK和ERK通路主要促进活化蛋白(AP-1)的表达，AP-1由Fos蛋白家族(c-Fos,FosB,Fra-1,and Fra-2)，Jun蛋白家族(c-Jun, JunB, and JunD)、和ATF蛋白家族(ATFa, ATF2, ATF4, and B-ATF)组成。虽然在生理情况下AP-1二聚体的精确成分尚未确定，但c-Fos和c-Jun蛋白组成的AP-1二聚体在破骨细胞分化中具有关键作用。而p38通路则通过激活mi/Mitf转录因子以调控抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)和组蛋白酶K(CTSK)的基因。Akt/PKB通路TRAF6与原癌基因Src的表达产物Src蛋白结合,Src刺激磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K),后者使Akt活化，从而促进相关转录因子的活化来抑制破骨细胞凋亡，调节破骨细胞骨架重排，促进其存活。

在RANK信号传导的中间阶段，作为RANK的重要下游靶点之一的活化T细胞核因子c1(NFATc1)被诱导。在破骨细胞前体细胞中，NFATc1被Ca2+依赖性钙调神经磷酸酶去磷酸化，使其从细胞质转移到细胞核以启动转录，钙螯合剂或钙调神经磷酸酶抑制剂如环孢素和他克莫司通过抑制NFATc1强烈抑制破骨细胞分化[12]。NFATc1缺陷型胚胎干细胞在RANKL刺激反应中不能分化成破骨细胞，并且在没有RANKL信号传导的基础上，NFATc1的异位表达导致前体细胞产生有效分化。因此，NFATc1可能代表了调节RANKL下游信号通路的破骨细胞终末分化的主开关[13]。而最近有研究表明，在破骨细胞内调节RANKL/RANK介导的信号传导通路中NFATc1不是唯一至关重要的，MYC通过依赖和独立于NFATc1的机制而作为介导破骨细胞中RANKL/RANK信号传导的重要分子[14]。

在RANK信号传导的后期阶段，诱导的NFATc1通过自我扩增并与其它转录因子共同作用激活并诱导破骨细胞特异性基因，例如TRAP、CTSK和破骨细胞相关受体(OSCAR)的表达，使其编码与破骨细胞分化、融合和功能相关的蛋白质介导完成分化过程。

RANK还具有TRAF非依赖性基序IVVY(535-538)，IVVY基序对于TNF/IL-1介导的破骨细胞生成具有关键作用，且与TRAF结合基序协同促进破骨细胞生成[15]。。

3 OPG/RANKL/RANK信号通路对雌激素水平、骨代谢的调控作用机制

雌激素是一种重要的骨量调节剂，在维持骨骼完整性特别是女性骨量方面起着重要作用。雌激素缺乏是绝经后OP的主要病因，同时血清雌激素生物利用度的降低也是老年男性骨质量和骨质流失的重要因素[16]。迄今为止，雌激素直接作用于抗骨吸收的作用靶点仍然未知[17]。雌激素通过与破骨细胞中的雌激素受体(,ERα)结合，降低RANKL/RANK下游信号通路中c-jun的活性，同时激活的ERα与支架蛋白BCAR1结合，形成ERα/BCAR1复合物抑制RANKL刺激的人单核/巨噬细胞的破骨细胞分化，并隔离TRAF6导致NF-κB激活减少和RANKL诱导的破骨细胞形成受损[18，19]。在许多植物性雌激素治疗OP的研究探讨中也证实了这一点，如毛蕊异黄酮通过抑制NF-κB和MAPKs的活化来下调NFATc1和c-Fos的表达水平，从而抑制RANKL诱导的破骨细胞分化[20]。体内和体外研究[21]还发现雌激素缺乏可导致T和B淋巴细胞增加，从而使RANKL的表达上升以激活破骨细胞、抑制破骨细胞的凋亡。研究[22]证实,骨细胞RANKL是雌激素缺乏引起骨吸收增加的所必需的因素，且骨髓上清液中可溶性RANKL蛋白的含量随雌激素缺乏而增加。OPG的表达强烈地依赖于雌激素，雌激素可直接刺激人成骨细胞系中的OPG表达。在绝经后妇女中，雌激素的缺失导致成骨细胞与骨髓基质细胞表面的OPG表达降低，RANKL活性相对升高，最终导致骨转换和骨吸收增加[23]。同时，应用植物性雌激素治疗后OPG mRNA表达升高，RANKL mRNA表达降低也证实了这一点[24]。此外，雌激素可经雌激素受体信号途径抑制炎症因子的表达，雌激素缺乏可上调促炎性细胞因子如白细胞介素-1(IL-1)、(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等间接发挥对破骨细胞介导的骨吸收作用[25]。因此，无论是雌激素与破骨细胞表面上雌激素受体结合发挥对破骨细胞的直接调控，还是与成骨细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞相互作用发挥对破骨细胞的间接调控，OPG/RANKL/RANK信号通路均发挥了重要作用。

4 OPG/RANKL/RANK信号通路在骨代谢免疫调节中的作用机制

表达于T、B淋巴细胞表面的RNAKL，介导二者的分化、调节调节性T细胞(Treg)稳态而参与中枢免疫耐受的建立、结合树突状细胞(DC)表面的RNAK促进其存活，并参与胸腺髓质和淋巴结免疫器官的发生，缺乏RANKL的小鼠表现出淋巴结器官发生缺陷[26]。同时，在许多自身免疫性和炎症性疾病、HIV感染、多发性骨髓瘤、骨转移性肿瘤等疾病的全身性反应中，普遍存在骨质丢失的现象。因此人们开始推测免疫系统与骨之间的关系，并提出了"骨免疫学"概念，认为RNAKL是连接两系统的重要分子之一。在类风湿性关节炎、牙周炎等自身免疫性和炎症性疾病中，活化的T淋巴细胞表达RANKL直接诱导破骨细胞形成导致骨破坏，同时产生TNF-α、IL-l、IL-6和IL-ll等促炎性细胞因子，促进成骨细胞和骨髓基质细胞RANKL的表达间接诱导破骨细胞生成介导骨丢失。因此T细胞通过直接表达RANKL或间接地通过促炎细胞因子介导非T细胞中RANKL的表达在关节炎和炎性骨溶解的疾病中介导骨损失和关节破坏[27]。在活化的T细胞亚群中，Th17细胞是唯一的破骨细胞生成性Th亚群,已成为包括OP在内的各种骨病发生的主要参与者之一[28]。Th17细胞通过分泌IL-17诱导成骨细胞上RANKL表达促进破骨细胞生成，同时刺激免疫细胞产生包括TNF-α、IL-1和IL-6在内的多种炎性细胞因子激活RANK信号进一步促进破骨细胞生成。相对于Th17细胞，CD4+T细胞亚群的Treg细胞已被证明是能够抑制RANKL诱导的破骨细胞生成，其作用机制目前尚不明确。因此，Treg细胞和Th17细胞之间的平衡可能在调节骨质破坏中起关键作用。除了T细胞外，B细胞通过表达OPG、RANKL参与骨调节。B细胞表达OPG降低、RANKL增加，导致RANKL/OPG比例失衡，是HIV感染的动物模型和人类体内骨质流失和骨折风险增加的主要原因[29]。

慢性低度炎症水平是生物衰老的主要特征[30]。IL-1、IL-6、TNF-α等促炎性细胞因子可能在绝经后OP与老年性OP中发挥重要作用。这些促炎性细胞因子介导的骨吸收与RNAKL密切相关。IL-1、IL-6和TNF-α不仅通过在骨炎症部位释放刺激成骨细胞RANKL的表达而间接诱导破细胞形成，而且可直接通过锚定它们在骨髓破骨前体细胞上的受体诱导破骨细胞分化[26]。

综上所述，骨重建受破骨细胞和成骨细胞间的活动受成骨细胞和破骨细胞之间的直接作用、骨代谢的神经内分泌系统以及免疫系统和骨细胞的局部相互作用调控。OPG/RANKL/RANK信号通路可通过调控骨重建三个途径参与OP的发生、发展。