PKCε生物学功能及其在神经系统疾病发生发展中作用机制的研究进展

米国霞,李生花

(青海大学医学院基础医学部, 西宁 810016)

蛋白激酶C (PKC)是由10多个不同磷脂依赖丝苏氨酸蛋白激酶组成的家族，根据分子结构和功能不同分为传统PKC(cPKC，包括α、βⅠ、βⅡ、γ)、新型PKC(nPKC，包括δ、ε、η、θ)、非典型PKC(aPKC，包括ξ、λ)[1]。不同类型的活化PKC可在同一细胞中发挥协同或拮抗作用，如在心脑缺血再灌注的情况下，PKC Epsilon(PKCε)和PKCθ可分别导致心肌细胞存活、凋亡；PKCα和PKCε通过调节整合素和内吞性运输的内化作用协同促进成纤维细胞的运动[2]。PKCε是不依赖钙但佛波醇酯/异酰基甘油依赖性的新型PKC同工酶之一。PKCε的受控激活在心肌缺血、阿尔茨海默病(AD)的发生、发展中起保护作用，但其具体作用机制尚不明确。PKCε的慢性激活可导致恶性肿瘤和糖尿病等疾病[3]。现将PKCε的生物学功能及其在神经系统中的作用机制研究综述如下。

1 PKCε生物学功能

PKCε高表达于脑部海马、海马回、嗅结节组织，大脑皮质中呈低表达[4]。PKCε结构包括N-末端调节结构域C2、C1、假底物，C-末端催化结构域C3和C4，包含ATP嘌呤结合位点、激活环和底物识别位点以及可变区域[1]。PKCε结构不同于其他PKC，其在C1a和C1b两个半胱氨酸之间有6个氨基酸(223～228，LKKQET)的肌动蛋白结合基序，C2结构域(14～21)具有RACK结合位点[2]，不是传统的钙结合位点。

PKCε通常以无活性的形式存在于细胞中，PKCε的活化是PLC介导的磷酸肌醇水解激活过程。因PKCε调节区有假底物序列，当激活剂第二信使DAG/TPA诱导激酶构象改变，暴露了底物结合位点，使得催化发生。PKCε磷酸化主要发在3个保守位点：激活环(苏氨酸566)、C端疏水位点(丝氨酸729)和自我磷酸化位点(苏氨酸710)。磷酸肌醇依赖性蛋白激酶(PDK-1)磷酸化激活环并触发疏水性基序磷酸化，而蛋白激酶的激活反过来激活PDK-1[1]。非磷酸化或低磷酸化PKCε的催化结构域直接联结锚定蛋白CG-NAP(中心体高尔基体定位的PNK蛋白)[3]。

活化的PKCε从细胞质易位到细胞膜。PKCε的激活与第二信使结合Cb1有关，二酰甘油和十三酸激活PKCε定位到质膜或细胞骨架，但是在花生四烯酸(AA)和亚麻酸定位到高尔基体上[3]。激活后的PKCε暴露肌动蛋白结合基序，与肌动蛋白微丝结合，这种蛋白与蛋白相互作用稳定地锚定PKCε到细胞骨架的基质，且肌动蛋白微丝作为分子伴侣维持激酶催化位点的构象[3]。衣被蛋白β-cop (RACK2，高尔基膜上参与囊泡运输的蛋白)是PKCε的接头蛋白，其与C2结构域结合将PKCε定位到高尔基体，RACK1蛋白将PKCε定位到整合蛋白(integrin βⅡ)，参与细胞外基质的细胞附着和移动[1]。由PKCε的C2结合位点鉴定一些PKC选择性激活剂和选择性抑制剂，在保护心脑缺血损伤和预防糖尿病，减轻疼痛和保护移植心脏的并发症具有重要影响[5]。

2 PKCε在神经系统性疾病发生、发展中的作用机制

2.1 PKCε在脑卒中发生、发展中的作用机制 中风死亡率位居世界第三，也是发达国家长期致残的最常见原因。导致脑中风的主要原因可能是短暂或永久性限制脑血液和氧供应。由缺血缺氧引起脑中风的机制到现在还不太清楚。有学者[6]认为，在脑缺血或再灌注损伤中，过表达的活性氧簇(ROS)对脑脂肪、蛋白和DNA引起氧化损伤，导致神经元功能紊乱及细胞凋亡。另有学者[7]认为饮酒获得的乙醇等毒性物质可导致脑中风，而线粒体醛脱氢酶2(ALDH2)活性降低。

目前PKCε被认为是治疗脑中风的一个潜在药物靶点。激活的PKCε可抵抗不同的应激性损伤。比如PKCε激活转录核因子红系2相关因子2(Nrf2)，Nrf2调节血红素加氧酶(HO-1)基因表达，最终启动抗氧化反应元件(ARE)区域，对脑中风具有保护作用[6]。异鼠李素(Iso)抑制Ca2+超载，促进PKCε磷酸化，清除RSO有效抑制细胞凋亡，PKCε抑制剂(εV1-2)则减弱Iso对N2a的保护作用[7]。PKCε的丝氨酸/苏氨酸磷酸化增强了线粒体醛脱氢酶2(ALDH2)翻译后的活性，升高ALDH2水平有利于减轻中风和其他氧化应激和醛毒相关疾病[8]。

在脑缺氧预处理(HPC)的脑保护中，PKCε参与HPC的大脑中动脉闭塞(MCAO)诱导的缺血性损伤[9]。在全脑缺血/缺氧的氧糖剥夺(OGD)期间， PKCε的激活通过BDNF/TrkB路径增加活性调节细胞骨架(Arc)表达，内化GluR2，降低AMPA受体电流幅度延长缺氧去极化潜伏期，对兴奋性毒素损伤起神经保护作用[10]。

PKCε可通过调控离子通道发挥抗缺氧保护神经元受损伤的作用。PKCε激活后磷酸化线粒体ATP敏感K+通道(mK+ATP )上Kir6.2亚基的Thr-224位点，降低兴奋性谷氨酸能离子通道通透性而起到了保护作用[11]。重组组织型纤溶酶原激活物(r-tPA)是联邦药物管理局批准用于缺血性中风的唯一治疗药物。r-tPA给药的时间窗口为3～4.5 h，患者发生出血性转化(HT)的风险升高，仅不到5%的中风患者能采用r-tPA治疗。有学者[12]对缺血性老年雌性中风(BBB)模型大鼠灌注r-tPA的同时，加用苔藓抑素灌胃，发现大鼠血浆基质金属蛋白酶(MMP-9)、PKCε水平均升高，大鼠发生HT风险降低。

2.2 PKCε在阿尔茨海默病(AD)发生、发展中的作用机制 AD是年龄相关神经退行性病变，其致病原因是β淀粉样蛋白(Aβ)的积聚和tau蛋白的磷酸化。Aβ分子沉积形成了低聚物，原纤维和成熟纤维，Aβ低聚物是AD研究的关键[13]。Aβ低聚物通过刺激磷脂成分和膜的负电荷而损害神经炎细胞膜的脂质双层，Aβ低聚物促进对细胞系统的毒性作用并且激活神经元死亡[14]。AD的主要临床表现为痴呆及记忆障碍。痴呆程度与AD患者脑部突触损伤相关，其分子机制可能是突触生成的PKCε和下游突触生成底物BDNF的表达降低[15]。载脂蛋白E4(APOE4)是几种神经变性疾病(包活AD)的主要遗传风险因素，APOE4增加人神经元中组蛋白脱乙酰酶(HDAC)的核易位，从而降低BDNF表达[16]。APOE3诱导PKCε的表达以及保留HDAC在细胞质，PKCε激活和APOE3补充阻止APOE4介导的BDNF下调，PKCε活性也逆转Aβ低聚物和APOE4诱导的HDAC的核易位[17]。临床前小鼠研究发现，苔藓虫素1治疗AD，逆转突触的丧失并促进阿尔茨海默病动物模型中的突触成熟，激活PKCε并增加了BDNF和PSD-95的水平[18]。目前，AD没有治疗疗法，但是现阶段设计和开发PKCε选择性配体，侧链不同的DAG-内酯的合成，发现具有环丙烷环的亚油酸衍生物充当PKCε的选择性和直接激活剂8-[2-(2-戊基 - 环丙基甲基) - 环丙基] -辛酸DCP-LA可有效地防止淀粉样蛋白斑的沉积和突触连接的丧失[19]。

2.3 PKCε在学习记忆中的作用机制 持续闭塞双侧颈总动脉引起的脑缺血/缺氧，以及手术完全恢复后的短暂缺氧，对年轻Wistar大鼠的空间学习和记忆产生了显着和持续的损害。多种信号通路和基因表达参与学习和记忆的过程，主要与神经元可塑性和大脑电路的持久变化有关。突触可塑性是持续的活动依赖性引起突触强度变化现象，突触可塑性分为长时程增强 (LTP)和长时程抑制(LTD)，LTP是对海马高频电刺激后兴奋性突触强度长期增强的主要形式[20]。有研究[21]发现佛波酯(PMA)通过激活PKCε和δ引起细胞外信号调节激酶(ERK)激活并促进海马神经元CA1区LTP增强。使用两种PKCε选择肽对老鼠的短期治疗，研究结果表明，使用PKCε抑制肽εV1-2显著损伤大鼠的识别记忆；而使用 PKCε的激活肽ψεRACK以时间依赖性方式增加MARCKS的磷酸化，激活Src,Raf和ERK[22]。研究[23]证实，PKCε激活剂DCPLA-ME和苔藓虫素1通过JNK1和CaMKⅡ信号通路直接磷酸化PSD-95s-295，增加PSD-95的水平而促进突出生成。

2.4 PKCε在肌萎缩侧索硬化症(ALS)发生、发展中的作用机制 ALS是一种神经退行性疾病，导致延髓和肢体功能逐渐丧失。5%～10%的ALS患者是家族性ALS(fALS)，大约20%的遗传性ALS病例是超氧化物歧化酶1(SOD1)基因突变引起的[24]。资料表示ALS的发病机制与线粒体功能紊乱、RNA错误加工、谷氨酸兴奋性毒性、蛋白的错误折叠和累计、生长因子缺陷等有关[25]。但PKCε是引起运动神经元损伤的一个上游信号。一些学者[26,27]认为ALS的发病机制是由于PKCε显著增强了外周蛋白的聚集，随后导致了神经细胞的死亡，根据这个机制认为通过隔离PKCε的C1b结构域，PKCε诱导的蛋白聚集和神经元凋亡可以被抑制。另有学者[28,29]认为在SOD1突变的ALS中，其星形胶质细胞中PKCε下调，导致mGluR5激活的钙震动丢失，如果上调PKCε，则恢复mGluR5介导的钙震动并且促进mGluR5介导的谷氨酸摄取的上调，说明星形胶质细胞中PKCε的表达下调是ALS发病的原因，也是损害神经细胞的原因。PKCε专门是位于神经肌接头(NMJ)的神经末梢处，受到突触活性调节并且参与药物佛波醇酯诱导的NMJ的ACh释放增强[28]。抑制PKCε阻止了成肌细胞和原代卫星细胞的肌原性分化，抑制PKCε会导致肌肉再生受损并减少肌细胞生成素和Mrf4的表达[31]。

综上所述，PKCε可通过激活转录核因子红系2相关因子2(Nrf2)调控血红素加氧酶(HO-1)表达；被丝苏氨酸磷酸化可升高线粒体醛脱氢酶2(ALDH2)活性，对脑中风起保护作用。同时PKCε可通过调节BDNF/TrkB路径、调控离子通道的关闭发挥抗缺血性损伤的神经保护作用。PKCε可通过抑制载脂蛋白E4(APOE4)的表达，进一步抑制下游突触生成底物BDNF表达，逆转Aβ低聚物和APOE4诱导的HDAC的核易位参与AD的发生发展。PKCε可激活细胞外信号调节激酶，促进海马神经元CA1区突触可塑性长时程增强参与学习和记忆过程。PKCε是引起运动神经元损伤的一个上游信号，可显著增强了外周蛋白的聚集，促进星形胶质细胞中mGluR5激活的钙震动丢失，导致神经细胞凋亡，参与ALS的发生发展。