p53基因在食管癌治疗中的表达及作用

张加勇　胡欣　文世民

(川北医学院第二临床医院·南充市中心医院肿瘤中心，四川 南充　637000)

食管癌是临床常见的消化道恶性肿瘤，肿瘤发病率位于全球第8位，死亡率位于第6位。我国食管癌发病率和死亡率均居世界首位，每年约21万人死于食管癌，占全球食管癌死亡患者一半以上[1]。食管癌高死亡率的主要原因是缺乏有效的诊断及治疗方法。食管癌发病机制复杂，研究发现其具有多阶段、多因素、进行性演进的特点，基本过程包括正常粘膜→基底细胞过度增生→不典型增生→原位癌→浸润癌[2]。在这过程中，有多种调整因子共同参与细胞的癌变。癌基因的激活和抑癌基因的失活是细胞癌变的分子基础。近年来，随着对分子生物学研究的发展，对于疾病的病因、发生、发展的研究已深入到了分子水平。基因治疗已逐渐从理论成为现实，具有：选择性强、副作用小、对晚期肿瘤及转移灶的治疗仍有效等优点，各类研究实验表明p53基因对食管癌的治疗有重要临床意义[3,4]。目前手术、放疗、化疗都是食管癌治疗的重要手段，而对于不能手术或不愿手术治疗的患者放化疗是该病治疗的主要手段，但中晚期食管癌的治疗效果仍不甚满意，因此利用p53基因治疗食管癌在临床应运而生，且已取得一定效果。本文将近年来p53基因与食管癌治疗的研究进展做一简要综述。

1　p53基因的结构及表达

p53基因位于染色体17q13.1，含11个外显子，其转录翻译编码的野生型P53(WtP53)蛋白由393个氨基酸残基组成，有多个功能域。主要由定位于氨基酸1-50位间的N-末端的转录激活结构域AD1、AD2与通用转录因子TFIID结合而发挥转录激活功能，p53与TFIID中的TAF结合，作用于下游基因启动子中的TATA box，起到转录激活功能；定位于氨基酸65-90位间的生长抑制结构域，富含脯氨酸，有5重复的PXXP序列，可与含SH3结构域的蛋白质相互作用，将p53与信息传递途径连接起来。另外还有：定位于氨基酸100-300位间序列特异的DNA结合结构域；定位于氨基酸残基316-325位间的核定位信号NLS；定位于氨基酸残基334-356位间的四聚体寡聚化结构域；C-末端非专一DNA调节结构域，可提供DNA损伤信号并参与核心区与DNA 结合的别构调节。P53蛋白含有DNA结合位点及多个蛋白质结合位点，其中F19、W23和L26为P53与MDM2蛋白相互作用所必需，其中F19、L22和W23参与P53与TAF 的相互作用[5]。

2　p53基因功能

p53的细胞内活性作用是介导DNA 损伤后的细胞应急反应，避免受损DNA 的堆积，维持遗传的稳定性，这主要体现在对细胞周期的阻滞、促进细胞凋亡和DNA 修复。此外，p53 还参与细胞分化、衰老的调节，以及抑制血管生成， 这些功能的完成均依赖于p53 与DNA 相互作用。作为转录因子，p53 可以调控下游多种基因的表达。

2.1　对细胞周期阻滞作用

在细胞周期调节中，p53主要监测与转录激活作用密切相关的G1和G2/M期校正点[6]。p53下游基因P21(WAF/CIP1)编码蛋白是一个依赖Cyclin的蛋白激酶抑制剂，一方面P21WAF1与一系列Cyclin-cdk 复合物结合抑制相应的蛋白激酶活性，导致高磷酸化Rb蛋白堆积，后者使E2F转录调节因子不能活化，导致G1期阻滞；另外P21WAF1可与PCNA结合，阻断DNA复制。p53的另外3个下游基因Cyclin B1、GADD45和I4-3-3则参与G2/M期阻滞。p53下调Cyclin B1表达，细胞则不能进入M期，GADD45通过抑制Cyclin B1-cdc2复合物的活性发挥作用，I4-3-3与cdc25c结合干扰Cyclin BI-cdc2复合物发挥录调节作用[7]。

2.2　促进细胞凋亡

p53可以上调bax的表达水平，以及下调bcl-2的表达共同完成促进细胞凋亡作用，bax 可与线粒体上的电压依赖性离子通道相互作用，介导细胞色素C 的释放，具有凋亡作用，bcl-2可阻止凋亡形成因子如细胞色素C 等从线粒体释放出来，具有抗凋亡作用。定位于线粒体的NOXA和P53AIPI等基因可直接被p53激活，其过表达能促进凋亡。p53还可通过TNF受体和Fas蛋白等死亡信号受体蛋白途径诱导凋亡。也有学者认为p53还可直接刺激线粒体释放高毒性的氧自由基来引发凋亡[8]。

2.3　维持基因组稳定性

DNA受损后因错配修复的累积导致基因组不稳定，遗传信息发生改变。p53基因的DNA结合结构域本身具有核酸内切酶活性，可切除错配的核苷酸，结合并调节核苷酸内切修复因子XPB和XPD的活性，参与DNA重组和修复。p53还通过与p21WAF1、GADD45 和PCNA形成复合物，利用自身的3'～5'核酸外切酶活性，参与DNA修复。p53参与DNA 修复过程的另一证据是在DNA损伤后p53能特异性诱导核糖核苷酸还原酶基因的表达，而后者在大多数生物体内调控DNA 错配后维持基因组的稳定性中发挥重要功能[9]。

2.4　抑制肿瘤血管生成

有研究认为在食管癌中p53基因和VEGF之间有正相关性。p53基因通过调控肿瘤组织中VEGF的表达引起肿瘤血管生成，从而促进肿瘤发生与转移。在P53+/VEGF+的肿瘤中，其微血管密度(Microvessel density，MVD)明显增高，且易发生颈淋巴结转移；而P53-/VEGF-的标本中MVD则较低，则多见于非转移组中。这些结果表明p53可能通过VEGF调节肿瘤血管生成的途径[10]。

3　p53基因与食管癌

p53基因是目前已发现的与人类食管癌相关性较高的抑癌基因。在所有的恶性肿瘤疾病中，人类肿瘤组织中有50%以上的p53基因会发生突变，在食管癌的发生发展过程中p53突变和高表达起重要作用，中国医科院肿瘤医院赫捷院士等对113对食管鳞癌和正常样本以及8种细胞系进行外显子组测序，发现在99%的病例中p53蛋白表达阳性率高达93%[11]。

p53基因与食管癌放化疗联合应用，主要是使用重组人p53 腺病毒(rAd2p53)为载体导入肿瘤细胞内发挥野生型p53基因的功能，p53诱导细胞凋亡是Ad-p53直接的抗肿瘤机制。Ad-p53属于C组5型腺病毒，主要依靠靶细胞表面的柯萨奇病毒和腺病毒受体(Coxsackie and adenovirus receptor，CAR)与细胞结合。而CAR在人类肿瘤中的表达水平通常比较低，因此阻碍了腺病毒介导的基因转移和抗肿瘤作用，吴雅琼等[11]通过研究认为Ad2p53对食管癌细胞的细胞毒性与腺病毒受体的表达基因正相关性。Lu Ping等[13]将45例诊断为食管鳞癌的不能手术或不愿手术的患者随机分为两组(rAd2p53+RT(治疗组n=22)和RT(对照组n=23))，结果显示治疗组的OR(等于CR+PR)及CR均高于对照组，其CR高于对照组3倍。王少龙等[14]采用随机单盲法将60例非手术食管癌患者分成单纯组(采用剂量60-70Gy的常规分割三野等中心照射)和综合治疗组(单纯放疗组+tAd-p53瘤体内局部注射每周一次，连续6周；同时配合每周两次共12次的肿瘤深部热疗)结果的两组的总有效率OR比较差异有统计学意义，且综合治疗组的严重放疗毒性反应的发生率显著降低。崔红利等[15]利用P53腺病毒注射液联合替吉奥治疗中晚期食管癌，分别在治疗4、8、12周观察疗效，其联合治疗组(p53腺病毒注射液联合替吉奥50 mg，口服，2次/d，d1-14×4)的有效率OR均约比单独化疗组(替吉奥50 mg，口服，2次/d，d1-14×4)高1倍。上述实验均认为p53基因可增加食管癌对放化疗敏感性，提高疗效，无明显副作用，是一种有前景的治疗方式，但Tomoki Makino等[16]通过对64位食管癌局部进展(T2-T4)病人行放化疗(40-60 Gy，低剂量5氟尿嘧啶+顺铂)前检测患者p53突变基因和P53免疫组化结果显示，无论P53免疫组化阳性与否，若患者p53基因突变阳性，则疗效极差，故研究者认为放化疗前对患者行p53基因突变与否的分析可了解患者的预后情况。

4　p53与其他基因对食管癌的共同作用

有关抗肿瘤基因的研究已从单基因研究进展到了两个甚至多个基因的研究，miR-34a基因是新近发现并备受关注的miRNA之一，MicroRNA(miRNA)是一种进化中高度保守的不编码蛋白质的小RNA，主要参与细胞增殖、生长、发育等许多复杂生命过程的调控[17]。在发现miR-34a之前，人们普遍认为参与p53调节网络的因子均为蛋白质产物。但是当研究人员在激活p53后对细胞中miRNA转录情况进行分析后，发现p53能够显著地诱导mir-34a的转录。这提示了p53基因可能直接地参与了非蛋白编码基因mir-34a的转录调控[18]。mir-34a主要在转录后水平抑制靶基因的表达，在肿瘤细胞中mir-34a表达量的减少能够提高靶基因的表达水平，从而使肿瘤细胞出现异常的增值。mir-34a与p53之间有着错综复杂的调控过程，首先p53通过调控许多miRNAs的表达，进而调节细胞周期、诱导细胞凋亡和衰老、抑制肿瘤发生[19, 20]。其次一些miRNAs又通过直接或间接调节p53基因或其上下游基因，参与TP53信号通路的调控，发挥重要的生物学功能[21]，Francisco[22]及龚朝建[23]等认为mir-34a不仅是增强p53表达那么简单，而是将p53基因的遗传毒性维持在一个稳健的系统水平，Zhimin等[24]报道，在野生型p53基因背景下，mir-34a的抗肿瘤效应主要是诱导增强p53蛋白及抑制sirt1基因的表达，而Hui等[25]认为在诊断明确的食管癌标本中mir-43a与p53基因没有关联性，其可能的原因首先是食管癌中p53基因常常发生突变，还有就是mir-43a基因甲基化。

长链非编码RNA(lncRNAs)是一类长度大于200 nt且不表现出任何蛋白质编码潜能的RNAs，对全基因组序列分析发现，在lncRNAs中特定的超保守元件与正常细胞的原癌基因有关，和p53基因等一样具有抑制细胞凋亡的作用。这类超保守元件异常表达可导致细胞发生恶性转化，引起肿瘤发生这类lncRNAs有H19、hotair、lncRNAs-LET等[26]，而最近对肝癌、膀胱癌研究发现lncRNAs-LET基因在肿瘤细胞中表达下调[27, 28]，同时有研究认为lncRNAs可能通过调节p53信号通路来调节细胞的生长[29]。Wang等[30]通过与正常组织对比发现在食管癌细胞中lncRNAs-LET表达降低，该结果表明LET可能与食管癌的进展及转移有关。他们认为LET可能也利用该通路诱导肿瘤细胞的生长和凋亡，利用Eca109和TE-1细胞株对比研究发现转染了LET的肿瘤细胞其p53基因表达显著增加，所以LET被认为可能激活p53基因的表达从而诱导食管癌细胞凋亡。

5　结语

在我国以鳞状细胞癌为主的食管癌具有自身的流行病学特点，同时在危险因素、基因谱、发病机制等方面有别于腺癌，但患者预后仍较差，目前仍缺乏最佳的治疗方案，新辅助放化疗+手术的综合治疗是当前局部晚期食管鳞癌比较公认的标准治疗， p53基因是目前发现与食管癌相关性较高的抑癌基因。多年来对p53基因的结构、蛋白质结构及相关功能已经有很深入的研究，同时与lncRNAs、mir-34a等基因的关系也有一定认识，在当前精准医疗的大力倡导下，若要基因治疗在临床广泛得到应用，让患者得到个体化治疗，无论是基础研究的还是临床问题的解决都需要投入大量的财力及精力。

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