生物传感器在玉米酶法浸泡工艺中的应用

刘庆艾，马恒，马耀宏，杨俊慧，孟庆军，杨艳，史建国

(齐鲁工业大学(山东省科学院)，山东省科学院生物研究所，山东省生物传感器重点实验室，山东 济南 250014)

在淀粉及淀粉糖生产中多釆用湿磨工艺生产玉米淀粉[1]，其中浸泡是玉米淀粉湿法加工过程中的一个重要环节，玉米浸泡的质量直接影响后道工序的正常生产以及淀粉的产量和质量[2-3]。因此，对玉米浸泡过程中的参数进行控制具有重要意义。由于分析方法的不足，以往研究多局限于传统控制参数，如温度、pH值、浸泡时间、亚硫酸浓度等，对浸泡过程中重要生化参数的变化规律缺乏深入了解。其中乳酸、葡萄糖、还原糖是反映浸泡过程变化最重要的生化参数，不仅能直接反映出浸泡液中内溶物的溶出程度和微生物的代谢活动，而且乳酸的含量对浸泡效果也起到重要作用[4-5]。因此，对乳酸、葡萄糖、还原糖的适时检测是浸泡条件优化及后续高品质淀粉生产的重要保障。

在传统的检测方法中，乳酸采用中和滴定法或比色法[6]，葡萄糖采用碘量法进行测定[7],还原糖则采用费林试剂法进行测定[8]，耗时、样品消耗量大且稳定性不好。本文采用生物传感器分析方法，对酶法玉米浸泡工艺过程的乳酸、葡萄糖、还原糖进行快速测定。

1 材料与方法

1.1 实验材料

玉米：含水量(质量分数)12.6%(菱花集团有限公司玉米淀粉生产车间)；酸性蛋白酶：酶活50 000 U/g以上(北京索莱宝科技有限公司)；其他试剂均为分析纯。

1.2 实验仪器

YP201N电子天平(上海菁海仪器有限公司)；303A2电热恒温培养箱(南通宏大实验仪器有限公司)；DHG系列电热恒温鼓风干燥箱(上海新苗医疗器械制造有限公司)；西厨多功能粉碎机(铂欧五金厂)；HHS恒温水浴锅(江苏国胜实验仪器厂)；LXJ64-01离心机(河北省吴桥电机厂)；SBA-40D型生物传感仪(山东省科学院生物研究所)；SGD- IV型全自动还原糖测定仪(山东省科学院生物研究所)。

1.3 实验方法

1.3.1 玉米浸泡方法

准确称取400 g玉米于浸泡罐中，加入1 000 mL 0.6%的乳酸溶液，50±2 ℃浸泡20 h；将玉米粗破碎，以1 000 U/g(玉米)的加酶量向浸泡液中加入酸性蛋白酶，50±2 ℃浸泡30 h。每隔2 h取样。

1.3.2 传统测试方法

1.3.2.1 滴定法[6]测定乳酸含量

取浸泡液50 mL，5 000 r/min离心10 min。取上清液2 mL于100 mL三角瓶中，加蒸馏水50 mL，用1 mol/L NaOH调节发酵液pH大于12，钙黄绿素指示剂0.02 g，用0.05 mol/L EDTA·Na2溶液滴定至背光由黄绿色转变为橙色为止，并记录消耗体积。

W=M*c*V/V0,

式中：W为乳酸含量，mg/L；V为滴定消耗EDTA·Na2的体积， L；V0为试样体积，L；c为EDTA·Na2的浓度，mol/L；M为乳酸摩尔质量，mg/mol。

1.3.2.2 碘量法[7]测定葡萄糖含量

准确移取玉米浸泡液25.00 mL和碘标准溶液25.00 mL于碘量瓶中，慢慢滴加2 mol/L NaOH，将碘量瓶加塞摇匀，放置15 min使之完全反应。加入2 mL 6 mol/L HCl，立即用Na2S2O3标准溶液滴定至溶液呈浅黄色，加2 mL淀粉指示剂，继续滴定至蓝色消失即达到滴定终点，记录数据，平行滴定3次。

W1=(c1V1-0.5c2V2)*M1/V3,

式中：W1为葡萄糖含量，mg/L；V3为浸泡液试样的体积，L；V1为碘标准溶液的体积，L；c1为碘标准溶液的浓度，mol/L；V2为滴定消耗Na2S2O3的体积，L；c2为Na2S2O3的浓度，mol/L；M1为葡萄糖摩尔质量，mg/mol。

1.3.2.3 费林试剂法[8]测还原糖含量

移取浸泡液溶液50 mL于400 mL烧杯中，加入费林试剂甲、乙液各25 mL。加盖表面皿，置电炉上加热，并在4 min内沸腾，再煮沸2 min，趁热用铺有石棉的坩埚抽滤，并用60 ℃热水洗涤烧杯和沉淀，至洗液不呈碱性为止。向坩埚中加入硫酸铁溶液和水各25 mL，用玻璃棒搅拌，使氧化亚铜完全溶解，用前面使用过的烧杯收集溶液，以0.1 mol/L高锰酸钾标准溶液滴定至微红色。同时取水50 mL，加费林试剂甲、乙液各25 mL，做试剂空白组。

X= (V4-V5)*c3*M2/V4,

式中：X为氧化亚铜浓度，mg/L；V4为试样消耗高锰酸钾标准溶液的体积，L；V5为试样空白消耗高锰酸钾标准溶液的体积，L；V4为试样体积，L；c3为高锰酸钾标准溶液的摩尔浓度，mol/L；M2为氧化亚铜摩尔质量，mg/mol。

由所得氧化亚铜质量按GB/T 5513-2008[8]查出还原糖质量。

1.3.3 生物传感器测试方法

利用生物传感器测定浸泡液中乳酸、葡萄糖、还原糖的含量，测定时每次取样量为25 μL,响应时间20 s，测定周期小于2 min,误差小于2 %。样品不需脱色、分离纯化就可直接测定[9]。

2 结果与讨论

玉米酶法浸泡过程表现出复杂的物理、化学和生物学变化，其中葡萄糖、还原糖的溶出与乳酸菌的产生有关[10]，而乳酸菌的生长又与乳酸的产生和葡萄糖、还原糖的消耗密切相关。

2.1 生物传感器测试浸泡过程中葡萄糖的变化规律

2.2.1 葡萄糖含量的变化

如图1所示，在开始乳酸浸泡的20 h内，浸泡液中葡萄糖的含量持续上升；酸性蛋白酶作用阶段，20～40 h这段时间内，浸泡液中的葡萄糖含量开始下降，而在40 h后又有一定程度的反弹上升。这可能是因为，在浸泡初始阶段，乳酸菌的生长不够旺盛，处于迟缓期，对葡萄糖的消耗的速率低于葡萄糖的溶出速率，因而前20 h浸泡液中的葡萄糖含量持续上升；20 h后，乳酸菌的生长处于对数期，对葡萄糖的消耗的速率高于葡萄糖的溶出速率，因而浸泡液中的葡萄糖含量开始下降；40 h后，乳酸菌的生长趋于稳定并开始衰亡，对葡萄糖的消耗量减少，因此浸泡液中的葡萄糖含量又有一定程度的上升。

图1 玉米浸泡过程中葡萄糖含量的变化曲线Fig.1 The changing curve of glucose in corn steeping process

2.2.2 还原糖含量的变化

浸泡过程中还原糖的变化规律与葡萄糖类似，如图2所示，在乳酸浸泡的20 h内，浸泡液中还原糖的含量持续上升；酸性蛋白酶作用的20～40 h这段时间内，还原糖含量开始下降，而在40 h后又有一定程度的反弹上升。这是由于浸泡液中还原糖主要是葡萄糖，因此浸泡过程中还原糖的变化规律与葡萄糖一致。

2.2.3 乳酸含量的变化

乳酸的产生与乳酸菌的生长有关，而乳酸菌的生长又与葡萄糖的溶出具有相关性。如图3所示，在开始乳酸浸泡的20 h内，随着葡萄糖的浸出，乳酸菌开始生长，浸泡液中的乳酸含量持续上升；酸性蛋白酶作用阶段，20～40 h这段时间内，浸泡液中的葡萄糖含量开始下降，乳酸菌的生长变缓，同时玉米粗破碎之后乳酸更容易进入籽粒内部，使得溶液中的乳酸浓度有所下降；随着浸泡的进行，玉米籽粒对乳酸的吸收逐渐达到饱和，因此在40 h后浸泡液中的乳酸浓度又有一定程度的反弹上升。

图2 玉米浸泡过程中还原糖含量的变化曲线Fig.2 The changing curve of reducing sugar in corn steeping process

图3 玉米浸泡过程中乳酸含量的变化曲线Fig.3 The changing curve of lactic acid in corn steeping process

2.3 生物传感器法与传统方法结果对比

表1 生物传感器方法与传统方法结果对比Table 1 Comparison of results of biosensor methods and those of conventional methods

如表1所示，利用生物传感器测定浸泡液中葡萄糖、还原糖、乳酸含量，其测试结果与传统测试方法相差不大。

3 结论

在玉米酶法浸泡过程中，采用生物传感器测定浸泡液中葡萄糖、还原糖、乳酸的变化规律， 具有响应速度快、结果准确、测试成本低等优点，并且样品不需要复杂的预处理就可直接测定，该研究为玉米淀粉生产过程优化和控制提供了新的分析方法和理论依据。

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