同步辐射X射线荧光和吸收谱技术在环境汞污染研究中的应用进展

李院霞，史雪倩，李红，白旭，张晨曦,3,#，李玉锋，赵甲亭,*，高愈希

1. 天津科技大学，天津 300457 2. 中国科学院高能物理研究所 中国科学院纳米生物效应与安全性重点实验室，北京 100049 3. 南开大学，天津 300071

汞是一种环境中广泛存在且毒性很强的重金属污染物，其污染来源主要是某些行业例如汞矿开采、金属冶炼、燃煤、氯碱工厂、PVC工业等。汞通过废水、废气、废渣进入环境，造成土壤、大气、水体、农作物中汞含量超标，这不仅对生态环境造成了损害，而且严重危害人体健康。东亚和东南亚是全球大气汞排放量最高的地区，共约占总排放量的39.7%，亚洲是世界汞排放量最高的地区占总排放量的31.8%[1]。我国的汞矿资源总保有量约8.14万吨，是世界上第三大产汞国，同时也是世界上煤生产、消费大国[2]。燃煤可使其中相当部分的汞进入大气，所以，我国部分地区的土壤、水以及空气存在较为严重的汞污染问题。我国汞污染区如贵州万山地区，部分水体、土壤、农作物汞污染严重。其中涉汞行业作业区周边土壤总汞含量高达0.33～790 mg·kg-1，甲基汞含量范围为0.19～20 μg·kg-1[3]。大米总汞含为2.4～401.0 mg·kg-1，平均含量为42.4 mg·kg-1，有51%的样品总汞含量超过我国食品汞限量标准(20 mg·kg-1)[4]。小秦岭地区的农作物例如蔬菜和小麦总汞含量可达到0.0417～0.636 mg·kg-1超过了规定的国家标准(蔬菜0.01 mg·kg-1)[5]。另外，近年来越来越多的研究证明，稻米甲基汞蓄积是我国居民甲基汞暴露的一条重要途径，对于农田环境、农作物尤其是水稻中总汞和甲基汞的研究越来越受到该领域研究人员的重视，由此对于环境介质以及农作物中总汞含量及其化学形态的分析要求也越来越高。

汞，不仅具有易迁移蓄积、不易降解等特点，而且在对其样品进行前处理及分析时易吸附不易冲洗，具有很强的记忆效应，这对于汞的精确分析，准确评价其生态、生理毒性带来了很大的挑战。目前对汞的研究手段主要包括，电感耦合等离子质谱仪(ICP-MS)、Lomax测汞仪、冷原子荧光光谱法(CAFS)、原子荧光光谱法(AFS)、原子吸收光谱法(AAS)测定总汞；高效液相色谱-质谱联用(HPLC-ICP-MS)、气相色谱-冷原子荧光(GC-CVAFS)等联用技术测定汞的形态。ICP-MS检测总汞含量具有灵敏度高、动态线性范围广、且可同时检测多种元素等优点[6]。该方法由于其样品前处理的方法和原子荧光、原子吸收类似主要是以消解为主，样品挥发以及不完全消解会导致降低检测结果的准确性。Lomax测汞仪技术无需消解过程且具备准确度高、测定速度快，是目前优选的一种测定固体样品中总汞简便快捷的好方法，但局限于只能检测固体样品的总汞含量。HPLC-ICP-MS联用技术可以检测样品汞形态，从而对样品进行定性、定量分析且检出限较低，该方法的不足之处是工作量较大、操作步骤较多、成本较高，样品分析时间较长等。GC-CVAFS是目前较先进的汞形态分析技术，不仅取样量少、消解过程简便省时，而且精密度、灵敏度较高，基质干扰低[7]，是一种较理想的甲基汞测定方法，但是它和Lomax测汞仪具有同样的局限性，且对样品前处理要求较高。总之，目前常用的汞分析检测技术虽然已具备了相当的精确度、低检出限等优势，但传统汞分析手段同样具有对样品前处理要求较高、程序比较繁琐，具有检测局限性等不足。因此，发展对样品前处理要求相对简单，分析精确度相对较高的汞分析检测技术，补足传统汞分析手段的不足，对于提高环境及食品汞污染分析水平，增强生态、健康风险评估的科学性是很有必要的。

同步辐射光源是一种具有从远红外到X光范围内的连续光谱，高强度、高准直性、高度极化和可精确控制等优异性能的脉冲光源，可以用以开展其他光源无法实现的许多前沿科学研究。目前，同步辐射分析技术已经广泛应用于各个科学研究领域。它可以对物质进行直接检测且取样量少，还原样品的真实性，实现对样品的原位无损分析，从而达到对样品进行微观结构分析的目的。其中在环境汞污染研究中主要用到同步辐射2种分析技术：同步辐射X射线荧光分析(Synchrotron X-ray Fluorescence Spectroscopy, SRXRF)和同步辐射X射线吸收谱分析技术(X-ray Absorption Spectroscopy, XAS)。两者光谱分析原理都是根据不同的原子具有不同的电子结构特征，当光束获得特定的能量打到样品上从而获得特征荧光或吸收谱[8]。同步辐射荧光分析技术(SRXRF)不仅可以得到荧光光谱图从而进行定性或定量分析，而且可以同时分析样品中多种元素的空间分布。相较于传统的XRF，SRXRF具有三大优势：第一，亮度比传统的XRF高出10个数量级[9-10]；第二，由于能量可调，可以检测到传统XRF无法检测的痕量金属和类金属元素[11]；第三，对于元素空间分布分析的分辨率较高，可以达到50 nm～20 μm[12]。同步辐射吸收谱分析技术(SRXAS)对于元素的化学形态十分灵敏，可以通过元素价态和指纹效应鉴别多种化合物，提供物质中元素的化学结构信息[13]。XAS的分析方法一般分为2种：X射线吸收近边结构谱(X-ray absorption near-edge structure, XANES)和扩展X射线吸收精细结构谱(Extended X-ray absorption fine structure, EXAFS)。汞污染研究常用到的XANES可以通过检测原子的氧化还原状态、局部微环境和配体的电负性等信息得到汞元素的代谢产物结构信息[14-15]，因此非常适合环境样品中汞的化学形态分析。结合同步辐射X射线技术分析优势，多种分析手段综合运用，可以有效分析环境介质以及动植物组织中痕量的汞，这对于提高对典型汞污染地区汞的生态毒理评价具有现实意义。

1 同步辐射技术在环境汞污染方面的研究(Research on SR technology in environmental mercury pollution)

环境汞污染评价首先要了解当地生态环境中汞污染情况，大气汞污染监测是研究当地汞污染程度的理想工具，其中颗粒汞是大气中汞的重要存在形式[16]。汞可以通过微生物等还原作用变成单质汞(Hg0)，它是大气中存在的主要汞形态，也是土壤向大气释放的主要汞形态[17]。Yue等[18]采用微区X射线荧光技术(μ-SXRF)与其他技术联合分析，通过对上海空气样品的检测识别出了空气污染物的来源如：冶金工业尘(18%)、汽车尾气(14%)、土壤尘(11%)、燃煤烟尘(9%)、柴油机排气(7%)、石油燃烧气(2%)和摩托车排气(1%)，通过对样品的进一步分析发现大气污染物的主要来源是冶金行业、汽车尾气的排放以及燃煤烟。这对地区大气汞污染溯源具有重要意义。张元勋等[19]利用SRXRF技术，通过检测苔藓植物来评估大气的污染程度，他们将苔藓植物暴露在污染区一段时间，用XRF对茎和叶片切片进行元素分布扫描，结果显示样品富集了K、Ni、Fe、Pb等元素，并且大气中污染元素的富集抑制了K、Ca等微量营养元素的吸收。Walker等[20]利用μ-SXRF技术对家庭不同活动区的灰尘进行元素分布扫描，结果发现样品含有S、Cl、K、Ca、Ti、Hg、Mn、Fe、Ni、Cu、Zn、As、Pb、Br、Rb和Sr，其中Pb、Zn、As的含量较高，分析得出这可能与装修有关，因为铅白和立德粉中含有较高含量这3种元素。

土壤汞污染的研究在汞的生物地球化学循环中起到至关重要的作用。Terzano等[21]采用同步辐射微区X射线吸收谱技术(SR μ-XAS)分析了土壤中汞的形态，通过对分析结果的近边吸收谱拟合表明该土壤中汞的形态主要为黑辰砂、辰砂、高溶解度的氯硫汞矿(Hg3S2Cl2)以及无定形态汞(Hg-S/Cl)，增加了环境风险；同时利用同步辐射微区X射线荧光分析技术(SR μ-XRF)对污染区的土壤进行了元素分布分析，根据汞分布蓄积图可以发现Hg的分布及含量变化趋势与元素Cl、S高度一致，但与Fe元素的分布特征没有明显的相关性，说明Hg有可能存在于一种含S和Cl的矿物中而不是与含铁矿物相结合。Xia等[22]通过SRXAS揭示了无机汞与腐殖酸复合物的结构信息，吸收谱图的拟合结果表明，在该复合物中，Hg2+主要与S和O结合，Hg-O键长为2.02 Å，Hg-S键长为2.38 Å。另外，Yoon等[23]利用吸收谱技术发现土壤中硫存在时会与CH3Hg+发生特异性结合，形成较为稳定的汞化合物。Qian等[24]和Skyllberg等[25]进一步证实CH3Hg+和Hg2+主要与土壤有机质(DOM)中的硫结合，而不会与O或N等其他原子结合，并且DOM可以将Hg2+还原为可溶性Hg0[26]。Gu等[27]发现在厌氧且无光照条件下，低浓度的DOM可以将Hg2+还原为Hg0，但随着DOM浓度的升高，Hg0的产率逐渐降低，也就是说土壤DOM与Hg的相互作用取决于两者的含量百分比及土壤微环境中的氧化还原条件。此外，Yin等[28]利用SRXAS分析了万山汞矿地区的矿渣发现，汞矿渣中黑辰砂占总汞52%，辰砂占42%，氯化汞占6%，再对比汞矿石中汞的形态发现汞矿冶炼过程中辰砂会转变为黑辰砂。在最近的一项研究中，Li等[29]针对新汞污染的土壤及添加硫后的汞污染土壤，对其进行SRXAS分析，研究结果表明，对照组土壤(非硫添加组)中汞主要以谷胱甘肽汞(Hg(GS)2)的形式存在(77%)，其次是HgS (～12%)和Hg2+(～10%)；分别添加硫酸盐和单质硫后，土壤中Hg(GS)2分别降低了约10%和23%，HgS百分比分别增加了约11%和23%。结果表明，硫添加可以显著降低新汞污染土壤中活性汞含量。同时，该研究还对土壤中硫化物进行了SRXAS分析，其研究结果进一步证明添加硫酸盐或单质硫显著促进了该汞污染土壤中硫化物(HgS)的生成(图1)。在Wang等[30]的研究中，研究人员利用SR-XANES结合透射

图1 汞污染土壤中汞的同步辐射X射线吸收光谱(SRXAS)分析(左)；汞污染土壤中硫化物的SRXAS分析(右)[29]注：Hg(GS)2表示谷胱甘肽汞；MeHgCl表示甲基汞。Fig. 1 Synchrotron radiation X-ray absorption spectroscopy (SRXAS) analysis of Hg in Hg contaminated soil (left); SRXAS analysis of sulfide in Hg contaminated soil (right)[29]Note: Hg(GS)2 stands for glutathione mercury; MeHgCl stands for methylmercury.

图2 汞和硒联合作用的大蒜根茎叶中汞和硒的同步辐射X射线荧光分析(SRXRF)成像分析[32]注：a～a1，单硒暴露大蒜根横截面硒的分布；b～b2，汞硒联合暴露大蒜根横截面汞和硒的分布；c～c1，单硒暴露大蒜鳞茎横截面硒的分布；d～d2， 汞硒联合暴露大蒜鳞茎横截面汞和硒的分布；e-f1，单硒暴露大蒜叶片中硒的分布；g～h2，汞硒联合暴露大蒜叶片汞和硒的分布。Fig. 2 Synchrotron X-ray fluorescence spectroscopy (SRXRF) imaging of Hg and Se in Hg and/or Se exposed garlic tissues [32]Note: a-a1, distribution of Se in Se exposed garlic root; b-b2, distribution of Hg and Se in Hg and Se co-exposed garlic root; c-c1, distribution of Se in Se exposed garlic bulb; d-d1, distribution of Hg and Se in Hg and Se co-exposed garlic bulb; e-f1, distribution of Se in Se exposed garlic leaf; g-h2, distribution of Hg and Se in Hg and Se co-exposed garlic leaf.

电镜-能量色散X射线光谱元素分析(TEM-EDX)技术探索了土壤中硒-硫-汞的作用，研究发现土壤中的汞更容易与硒而不是与硫结合生成较为稳定的纳米HgSe复合物。随着同步辐射技术的发展，由于其具有无可比拟的分析优越性，在环境污染领域，国内外越来越多的研究开始应用该技术分析土壤、水体及大气汞的污染特征，使得相关研究取得了很大的进展，在此不一一赘述。

2 同步辐射技术在植物汞污染研究中的应用(Application of SR in the study of plant mercury pollution)

近些年来，同步辐射技术不仅在环境介质中汞污染分析的应用逐渐增多，对于动植物体中汞污染、毒性特征分析方面的应用也取得了很大的进展。利用不同同步辐射X射线技术手段，可以同时分析汞在生物组织微区中的分布蓄积形式和该组织微区中汞的化学形态，该分析技术结合常规的色谱、质谱分析手段的应用，显著提高了对于汞生物毒性评价的准确性和精确性。Zhao等[31]利用SRXRF结合SRXAS方法，分析了汞在水培大蒜中的组织微区分布和存在形式，结果发现在大蒜的根部汞主要分布在其表皮和中柱组织部分，且主要以类似Hg(GS)2和蛋氨酸汞(Hg(Met)2)的结合形式存在(>60%)。另外，对大蒜中硒和汞拮抗的SRXRF和SRXAS研究[32]表明，添加硒后，由于硒汞拮抗作用，硒显著降低了汞在根部导管部分的蓄积，表明硒抑制了大蒜对汞的吸收和转运，同时汞也可以显著抑制大蒜对于硒的吸收和转运，通过这种拮抗作用，降低了汞和硒对该植物的毒性(图2)。Jar McNear等[33]利用SRXRF及XANES技术也发现汞硒暴露洋葱中汞主要分布在其根部表皮层，而硒分布于整个根部组织；硒汞作用在根部可以形成稳定的硒汞复合物。

Carrascogil等[34]通过对汞暴露的野生苜蓿植物根部的SRXRF成像分析发现，汞主要分布在苜蓿的根尖和导管组织部位，利用EXAFS技术的研究表明进入该植物组织中的汞主要以硫醇盐或蛋白质复合物的形式存在。Rajan等[35]利用SRXAS技术研究了葫芦植株在有氧、无氧条件下的汞甲基化情况，结果发现有氧时甲基汞约占总汞的5%，但厌氧条件下甲基汞含量上升了大约11%。这说明水葫芦植物在厌氧的条件下出现了汞的甲基化现象。Patty等[36]利用SRXRF及SRXAS对米草根部汞吸收与转运进行了研究，结果表明汞主要分布于根部表面，并且可能与根表铁膜等结合。

近年来，越来越多的研究表明水稻对于汞具有一定的蓄积能力，因此对汞污染稻田及水稻的研究显得尤为重要，提高分析的准确和精确性对于汞污染稻田的生态风险评估，及以大米为主要粮食作物的人群的健康风险评估都具有重要现实意义。同步辐射X射线技术，具有原位无损分析优势，可以大大简化样品前处理的步骤，对于分析时保证样品的原始理化性质具有很大的帮助，减少前处理带给样品的外界因素，这样可以显著提高分析的准确性。在Li等[37]的研究中，通过诱导水稻根表铁膜形成，利用SRXRF分析水稻根表Hg-Fe的分布蓄积关系发现，根表铁膜的形成可以吸附大量的汞，促进了汞在水稻根表的蓄积，阻抑根部吸收汞进入导管组织，从而抑制了水稻对汞的吸收和蓄积(图3)。

图3 无机汞(IHg)暴露水稻根部Fe和Hg的SRXRF成像(a，无铁膜；b，有铁膜)；甲基汞(MeHg)暴露水稻根部SRXRF成像(c，无铁膜；d，有铁膜；e，f，根部纵向Fe、Hg的XRF成像)[37]Fig. 3 Fe and Hg SRXRF imaging of inorganic Hg (IHg) and methyl Hg (MeHg) exposed rice root (left, IHg exposed group; right, MHg exposed group; a, c, for Iron-free film; b, d, for Iron film; e, f, for Root portrait)[37]

Zhao等对汞污染水稻进行硒干预，通过SRXRF分析表明汞和硒在水稻根、茎叶和籽实中的分布特征高度一致，对于水稻的可食用部分稻米的纵切面进行SRXRF成像分析发现汞和硒主要蓄积在稻米的胚芽和背面表皮糊粉层组织部位，在胚乳部位含量极低；硒干预显著降低了稻米胚芽部位汞的蓄积水平，提示硒对于降低稻米汞含量具有显著效果，而且硒可以降低汞对于水稻的生殖生长毒性(图3)。Wang等[38]在探索水稻中MeHg与Se拮抗作用机理的实验中，借助于SRXANES技术发现加硒后土壤和水稻中MeHg含量降低的一个重要原因是水稻根际汞和硒发生反应生成难溶性的HgSe复合物，阻滞了汞的甲基化途径，从而降低了微生物甲基汞产率。

Li等[39]在进一步的实验中，通过对贵州清镇汞污染稻田选取一定区域进行不同剂量硒干预补充后种植水稻，利用SRXRF/XANES结合ICP-MS分析证明硒与汞在水稻根际及根部皆生成大量的HgSe化合物，从而抑制了水稻对汞的吸收蓄积，降低了稻米中汞的含量(图4)。对于水稻中硒和汞拮抗作用的分子机制研究，Li等[40]综合利用SRXRF技术分析了水稻根部汞和硒响应蛋白的种类及其表达量的变化情况，通过SRXRF扫描成像电泳凝胶中硒或/和汞的响应蛋白质条带，并对其进行质谱分析，结果表明硒干预可以显著降低汞与水稻根部小分子蛋白的结合，促进汞与大分子蛋白质的结合，通过该途径使汞的活性降低，从而降低汞的植物毒性。

图4 水稻中硒和汞分布蓄积的SRXRF成像分析[32]注：a，Hg暴露下水稻根尖Hg分布；b，Hg和Se暴露下水稻根尖Hg、Se分布；c，Hg暴露下水稻叶子Hg分布； d，Hg和Se暴露下水稻叶子Hg、Se分布；e，Hg暴露下稻米的Hg分布；f，Hg和Se暴露下稻米Hg、Se分布。Fig. 4 SRXRF imaging of Hg and Se in rice plant [32]Note: a, Hg distribution of rice root tips exposed by Hg; b, Hg and Se distribution of rice root tips exposed by Hg and Se; c, Hg distribution of rice leaf exposed by Hg; d, Hg and Se distribution of rice leaf exposed by Hg and Se; e, Hg distribution of rice exposed by Hg; f, Hg and Se distribution of rice exposed to Hg and Se.

图5 SRXRF/XANES结合电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)技术研究土壤-水稻体系中硒汞拮抗作用的机制[39]Fig. 5 Mechanism of Hg and Se interaction in the soil-rice system studied by SRXRF/XANES combined with inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) techniques [39]

另外，Meng等[41]利用SRXRF发现Hg、Cd、Se、Mn、Cu、Zn等元素主要蓄积在稻米的果皮和糊粉层，同时结合SRXAS技术探知稻米中无机汞主要以跟半胱氨酸或植物螯合肽的结合形式而存在，推测甲基汞主要以与半胱氨酸等结合的形式存在于金属蛋白质中。Xu等[42]利用SRXANES结合HPLC-ICP-MS技术对甲基汞暴露的水培水稻整体植株进行分析，通过对SRXANES谱图进行最小二乘法拟合发现，甲基汞暴露水稻根和茎叶组织中存在大量无机汞化合物，该实验结果提示该品种的水稻体内可能存在一种甲基汞去甲基化的途径。

3 总结与展望(Summary and outlook)

由于汞本身具有高毒性、易迁移蓄积、易吸附和不易降解等特点，一直以来对于环境介质，例如大气、土壤和水, 中汞及农作物组织中汞含量及形态的分析，不管是样品前处理过程还是分析方法的建立及仪器分析都有很高要求。同步辐射X射线荧光和X射线吸收谱是目前最有效的微观成像、元素成分分析的检测手段之一，且因其独特的检测优势，在环境科学领域应用越来越广泛和深入。同步辐射分析无需复杂的样品前处理过程，可直接对土壤、水和植物组织等介质进行原位无损分析，从微观层面如分子结构、价态、键长、键角等到宏观元素分布分析都可以实现，弥补了常规仪器测汞的一些弊端，为环境、农产品汞污染生态毒理评价、污染修复和治理等提供快速准确的分析手段以及有力的实验证据。同时，我们也应该意识到，同步辐射技术在环境汞污染检测分析方面也有其固有的缺陷性，例如检出限不够低、光斑尺寸仍相对滞后于高分辨研究发展的需要、较难分析部分敏感样品，如造成动植物组织的辐射损伤等。因此，进一步提高新一代光源的性能和稳定性，获得更高亮度及更小尺寸光斑，既符合研究需要也是大势所趋。此外，新型能量探测器的改进以及研制有望进一步提高同步辐射光对于汞分析检测的分辨率和灵敏度。总之，随着科研人员对于环境及生物体汞污染研究手段要求的提高和对于同步辐射X射线荧光和吸收谱技术的深入了解和广泛应用，结合常规汞分析仪器的实用，这必将使得同步辐射技术在环境汞污染的生态毒性、动植物汞生理毒性评估方面呈现出更大的优势，提高环境汞污染评估水平。