犬冠状病毒BC-1株核衣壳蛋白的原核表达及生物信息学分析

王 静，梁 琳 ，罗亚坤，袁维峰 ，崔尚金★

（1.中国农业农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193；2.农业部兽用药物与兽医生物技术北京科学观测实验站，北京 100193）

犬冠状病毒(Canine coronavirus,CCoV)感染犬并引起以胃肠炎为主要症状的高度接触传染病，一年四季均可发生，但冬季多发，主要感染犬科动物，其他动物如大熊猫等也具

★通讯作者：崔尚金(1971～),男,山东省青州市人,研究员,博士生导师。有易感性，对幼龄犬危害最为严重。1971年在一只患有腹泻的德国军犬中首次报道了CCoV感染，目前已呈世界性分布；1995年，我国首次从患病犬的心脏和胃肠内容物中分离得到CCoV，并于2009年从死亡的大熊猫中分离到。CCoV与其他病原体如犬细小病毒共感染时往往导致致死性腹泻。近几年，CCoV变异株的出现，可导致犬全身感染以及犬的高死亡率，给养犬业、经济动物养殖业和野生动物保护带来沉重的打击。

N蛋白是CCoV颗粒中比较丰富的结构蛋白，与病毒RNA紧密结合构成病毒的核心。N蛋白不仅对RNA的转录起重要作用，而且还是免疫识别的相关靶位点，可介导宿主细胞免疫。

1 材料与方法

1.1 病毒株、质粒及菌株

犬冠状病毒BC-1株、小鼠抗N蛋白抗体和表达载体pET-32a由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所宠物疫病防控创新团队实验室提供；pMD19-T载体购自宝生物工程（大连）有限公司；DAB显色试剂盒购自江苏康为世纪科技有限公司。

1.2 主要试剂

病毒RNA快速提取试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司；M-MLV反转录试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA凝胶回收试剂盒购自OMEGA公司。

1.3 引物设计与合成

根据GenBank中登录的CCoV（ AB781800.1）基因组序列，利用DNAStar和Primer Premier 5软件，设计一对引物，用于扩增CCoV N基因目的片段，序列为：CCoV-N-F:5′-CGGGATCCATGGCCAACCAGGGACAACGCG-3′CCoV-N-R:5′-CGGAA TTCTTAGTTCGTTACCTCATCAATAATC-3′(下划线碱基分别是BamHⅠ和EcoRⅠ)，预期片段长度为1165 bp。引物由北京华大生物科技生物技术有限公司合成。

1.4 重组表达载体的构建

重组表达载体pET-32a-CCoV-N的构建与鉴定参照文献进行。

1.5 表达条件的优化

采用不同的诱导时间和不同的IPTG浓度摸索N蛋白的最适表达条件。

1.6 表达产物的SDS-PAGE分析

采用12%SDS-PAGE凝胶电泳检测目的蛋白的表达情况。

1.7 重组蛋白的western blot鉴定

将重组蛋白经12%SDS-PAGE凝胶电泳后，利用半干法电转移至硝酸纤维素膜（NC膜）上，用TBST配成的5%脱脂乳4℃封闭过夜；以鼠抗His标签MAb（1:2000稀释）为一抗，山羊抗小鼠IgG-HRP（1:5000稀释）为二抗，利用DAB显色试剂盒进行显色。鉴定得到特异的目的条带后利用鼠抗N蛋白的抗体作为一抗按照相同的方法进行western blot检测。

1.8 序列分析

利用DNAStar中的MegAlign软件对CCoV BC-1株N基因与GenBank发表的6株CCoV参考株序列进行比对，并用Mega 5.0软件对其进行遗传进化分析，绘制遗传进化树。

1.9 生物信息学分析

应用 Protparam在线软件（http://web.expasy.org/protparam/）对犬冠状病毒BC-1株N基因编码产物的理化性质进行预测；应用 InterProScan（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）分析N蛋白的结构与功能。利用SOPMA（http://metadatabase.org/wiki/SOPMA）软件预测N蛋白的二级结构；应用DNAS-tarProtean软件，预测N蛋白的B细胞抗原表位。

2 结果与讨论

2.1 N基因的克隆与表达

RT-PCR结果显示在约1165 bp处有目的片段，构建了表达载体，利用优化的条件表达菌体，超声破碎后离心，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，结果显示，上清几乎无目的蛋白，而沉淀在62 ku处出现明显的特异性条带，故表达的N重组蛋白主要以包涵体形式存在（图1）。

图1 N基因RT-PCR扩增

2.2 western blot分析

分别利用鼠抗His标签的抗体和鼠抗N蛋白的抗体作为一抗进行western blot鉴定，结果显示得到与预期相符的大小分别为62 ku和43ku的特异性目的条带（图2），表明正确表达目的蛋白（His-N）。

图2 CCoV蛋白的Western blotting分析

2.3 CCoV BC-1株N基因的遗传进化分析

利用生物软件Mega 5.0最大相似法构建系统进化树（图3），结果显示犬冠状病毒BC-1株与CCoV A76株和CCoV HLJ-072株位于同一分支中，有较近亲缘关系。

图3 N基因核苷酸序列的系统进化树分析

2.4 生物信息学分析

理化性质预测表明N基因全长为1149 bp，编码个382氨基酸，赖氨酸和丝氨酸含量最高。丝氨酸易于形成β-转角，而赖氨酸易于形成α-螺旋，所以N蛋白可能具有高度缠绕和螺旋的结构。N基因的亲水性平均系数（GRAVY）是-1.190，为亲水性蛋白，有利于N蛋白的高效表达。应用InterProScan软件分析N蛋白的结构和功能域（图4A），从预测结果可知，第6～164位为RNA结合结构域（SSF110304)，在体内能够结合冠状病毒产生的RNA序列；第229～335位为核衣壳蛋白二聚体结构域 (SSF103068)；第1～29位、第121～240位和第 328～362 位为紊乱区（mobidb-lite），对这两个结构域功能不知，也未见相关报道（图4A）。利用在线软件SOPMA预测，结果表明N蛋白二级结构无规则卷曲所占比例最大,这可能使得N蛋白特定功能活性部位具有较大构象柔性，有利于与病毒RNA结合，也易于形成抗原表位（图4B）。 应用DNAStar Protean软件，结合N蛋白的灵活性、亲水性、表面呈现性和抗原指数预测N蛋白含有9个潜在优势 抗 原 表 位 ， 分 别 位 于 N 端 第 11～29、73～75、80～88、154～188、210～234、180～182、210～230、312～319 和 346～350位（图4C）。由于未考虑各氨基酸之间的分子间作用力和立体结构的限制，因而试验结果只能作为确定N蛋白潜在优势抗原表位的参考。

3 小结

本研究对犬冠状病毒BC-1株N蛋白进行原核表达并对其进行生物信息学分析，为N蛋白的进一步研究提供了基础。由于核蛋白的高度保守性及其在致病性和病毒复制及转录过程中的作用，通过其在体外的大量表达，可作为诊断抗原，也可用其制备抗血清及单克隆抗体进行疾病诊断；同时N基因的克隆与表达，为进一步探讨该病毒的分子致病特性及新型抗病毒药物的研制提供基础。

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图4 CCoV BC-1株N蛋白的分子结构和功能预测