结核RNA聚合酶的电镜研究

崔宇润

（北京十一学校高三五班，北京 100039）

1 背景

1.1 结核分枝杆菌的危害

结核杆菌（TB）侵入人体或者动物机体后引起结核病，结核病是一种具有强烈传染性的慢性消耗性疾病。它不受性别、种族、年龄、职业、地区的影响。人体或者动物机体的许多器官、系统均可感染结核杆菌造成结核病，其中以肺结核最为常见。其中90%以上的肺结核是通过呼吸道传染而来的。肺结核患者可以通过咳嗽、打喷嚏，使带有结核杆菌的飞沫喷出体外。健康人或者易感动物吸入结核杆菌后便会感染发病。

（1）致病性 结核杆菌的致病作用可能与细菌在组织细胞内顽强增殖而引起的炎症反应，从而诱导人或者动物机体产生迟发性变态反应性损伤有关。结核杆菌主要通过呼吸道、消化道和破损的皮肤黏膜等进入人体或者动物机体，侵犯不同组织器官，引起对应器官的结核病。

（2）抵抗力 结核杆菌具有很强的抵抗力，对某些理化因子的抵抗力较强，大部分可在干痰中存活6～8个月。对湿热、紫外线、酒精的抵抗力弱。在强酸强碱溶液中能耐受30min。但在液体中加热到62℃～63℃15min，直射日光下2～3h，或75%酒精内数分钟就很快死亡。

（3）传染性 结核杆菌的传播方式主要呼吸道、消化道和破损的皮肤黏膜等传染，随地吐痰最直接污染了生活的环境，是传播该病的元凶。另外还有消化道传染，因为除了人以外，牛等动物也会患结核病，如果母牛患结核病，其奶中也会带有结核杆菌，若人喝了带有病菌的生牛奶，就会感染结核病。结核杆菌侵入人体后是否发病，除与细菌的数量和毒力都有关，还与人体和动物机体对结核杆菌的抵抗力有关。如果机体抵抗力（免疫力）低下，结核杆菌的入侵不能被机体防御系统消灭，就会不断繁殖，引发结核病。

痰涂片检查显示，抗酸杆菌阳性的结核病患者才具有传染性，而且也才是结核病的传染源。传染性肺结核患者的肺部病灶有很多结核杆菌，当咳嗽或打喷嚏时，会有大量的结核杆菌从呼吸道播散出来，附着在空气的飞沫里，并长时间悬浮在空气中。如果健康人或动物吸进这些含有结核杆菌的飞沫就有可能受到结核杆菌的感染，并在肺部形成病灶。因此，结核病的传染性与患者的病情、排菌量、咳嗽的频率、居住房子的通风情况及接触者的密切程度及抵抗力有关。

1.2 结核分枝杆菌的抑制药物

结核病是一种慢性缓发的重大传染性疾病，通过呼吸道传播，主要发生人体肺部感染，同时，颈淋巴、脑膜和腹膜等组织也可继发感染。病灶里出现结核结节，并伴有干酪样坏死，临床上主要表现为全身症状、咳嗽和咯血等症状。该病的病原体是结核分枝杆菌，这是一种生长缓慢的需氧菌，外形呈棒状。早期的药物（如利福平、异烟肼等）对结核杆菌具有良好的抑制作用，在临床应用中产生了很好的效果。然而近年来，滥用药物致使耐药性结核杆菌和超级耐药性结核杆菌的出现，造成抗结核药物的药效急剧下降。因此，寻找新型药物靶点研发抗结核药物迫在眉睫。

1.3 聚合酶德抗结核作用

1.3.1 DNA聚合酶Ⅰ DNA聚合酶Ⅰ是在DNA双螺旋结构模型提出后被发现的，阿瑟·科恩伯格在研究过程中起到至关重要的作用。在其研究成果的推动下，大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ得到进一步揭示，并催生了PCR技术的问世，同时也促进了其他DNA聚合酶的发现。

早在1955年，M.Crunberg-Manago和S.Ochoa就已报道分离出了催化合成RNA的酶，尽管人们随后发现他们分离得到的酶是多聚核苷磷酸化酶，但是他们发现的酶在M.Nirenberg和J.H.Matthaei合成第一个遗传密码子中发挥了重要作用。S.Ochoa因阐明RNA生物合成机制而获得了1959年诺贝尔生理学／医学奖。1959年，美国科学家J.Hurwitz在大肠杆菌的抽提液中分离得到了真正的RNA聚合酶。与此同时，S.B.Weiss在大鼠肝细胞核提取物中也发现了参与RNA合成的物质。他们发现，提纯的RNA聚合酶在体外能够以DNA为模板，在加入ATP、CTP、CTP、UTP及Mg2+等后合成RNA，合成的RNA与DNA模板链完全互补。DNA聚合酶被正式发现，证实了DNA双螺旋结构模型的正确性，并说明DNA是能自我复制的分子，标志着人类首次掌握了制造遗传物质的方法。

1.3.2 近年来的研究热点 近年来，随着真核细胞DNA体外模型的构建与建立，蛋白纯化技术的广泛提高和应用，以及对DNA聚合酶基因的克隆技术，对真核细胞DNA聚合酶研究取得了飞速进展。目前已经在人体细胞中发现了15种DNA聚合酶，可以分为以下4类：A类,包括γ、θ及其它聚合酶,γ是目前发现的唯一存在于线粒体的聚合酶。在今年，酵母菌RNA、人RNA也发现了类似的研究。

其他原核生物的RNA pol在结构和功能上均与大肠杆菌相似。抗生素——利福平（rifampicin）或利福霉素可以特异抑制原核生物的RNA pol，成为抗结核菌治疗的药物。它专一性地结合RNA聚合酶的β亚基。并在转录开始后加入利福平，仍能发挥其抑制转录的作用，这说明β亚基是在转录全过程都起作用的。

1.3.3 立题依据及意义 本课题建立的原因是结核杆菌（TB）RNA聚合酶还没有电镜研究，因此结合现代分子生物学的发展和电镜的快速发展，可以直观的观察到RNA聚合酶效果。

2 实验方法

2.1 目的蛋白的表达及纯化

2.1.1 载体的构建 利用大肠杆菌质粒表达系统，将目的蛋白DNA序列导入大肠杆菌质粒（5亚基分别转入），培养该大肠杆菌，提取蛋白。

2.1.2 用BL21表达目的蛋白，细胞溶菌作用释放蛋白质。2.1.2 用Ni-NTA agarose beads孵化，盐溶液清洗。

2.1.3 拿咪唑和buffer配，从0、20mM、40mM......100mM浓度进行洗脱。

2.1.4 SDS-page检测。

2.2 负 染

2.2.1 用一根细的吸管吸一滴样品悬液，滴到有膜的铜网上，滴样时要注意防止铜网污染，如注意通网是否被液体吸到管上来或翻转而被污染。

2.2.2 制样用碳膜，用镊子夹着铜网，滴液后静置10min，然后用滤纸从铜网边缘吸去多余液体，滴负染色液，1～2min染色后用滤纸吸去负染色液，滴蒸馏水在铜网上洗1～2次，用滤纸吸去多余水分，待干后用于电镜观察.

2.2.3 干燥时，由于表面张力的作用，某些敏感的材料可能受到损伤，可用戊二醛或四氧化锇预固定。预固定在滴样之后进行。

2.3 冷冻样品制样

包括制样过程、制样方法。

2.3.1 冷冻方法制备样品低温扫描电子显微术是80年代迅速发展和广泛应用的方法。冷冻固定将生物材料投入低温的致冷剂中，如液氦、液氮、液体氟利昂及丙烷等。它包括生物样品的冷冻固定、冷冻干燥、冷冻割断和冷冻含水样品的扫描电子显微术等。快速冷冻可使生物组织细胞的结构和化学组成接近于生活状态。被冷冻固定的生物样品，可以在低温条件下转移到具有低温样品台的扫描电子显微镜中直接观察无需进一步处理或仅在冷冻样品表面喷镀一薄层金属。这种方法不仅快速简便，而且可以排除由于干燥法造成收缩的假象，特别适合于研究含水量很高的生物材料。

2.3.2 切片样品厚度大于5 mμ高压冷冻，然后切片，检查冰层、样品分布。

2.3.3 观察与结果统计观察以后，最后进行结果统计。

3 结果

3.1 目的基因的构建、蛋白制备及纯度测定

利用大肠杆菌质粒表达系统，将目的蛋白DNA序列导入大肠杆菌质粒（5亚基分别转入），培养该大肠杆菌，提取蛋白并进行纯化，然后利用SDS-PAGE测定蛋白纯度。结果如下图1，从图中可以看出纯化后胶图由多条带变为一条带，因此得到了高纯度的表达蛋白。

图1 表达的结核RNA聚合酶蛋白的SDS-PAGE试验

3.1 负染图

将得到的蛋白进行电镜负染，得到了如下的结果。见图2。由图可知，颗粒形态为一个大的椭圆形颗粒延伸出一小颗粒结合的形状，且大部分颗粒形状相似，整体分散较均匀，浓度适中，有部分区域聚集，因此得到的蛋白纯度单一，大小一致。

但是含有杂质，需要进一步再多做样品确定是否适合做电镜实验。

图2 表达蛋白的电镜负染结果

3.2 冷冻图

进行冷冻试验的电镜观察，得到如下的结果。见图3。结果被初步揭示RNA聚合酶复合体的三维冷冻电镜结构，但还不是很清楚，需要进一步的观察和筛选统计。

4 讨论

本实验利用现代分子生物学技术表达了结核RNA聚合酶蛋白，并进行了蛋白纯化、SDS-PAGE检测，以及负染电镜和冷冻电镜的观察。初步学会了蛋白表达、纯化的方法，及负染电镜和冷冻电镜的观察等技术过程。在本实验中存在如下难点，有待今后实验解决。

图3冷冻试验的电镜观察结果

4.1 如何确定五个亚基的均一性，我们初步考虑用复染进行确定。4.2 表达蛋白不均一的解决办法：初步考虑由交联方法解决。4.3 冷冻制样，蛋白小如何保证衬度和趋向：这个要控制影响因素，制样条件很多，需要进一步的摸索，包括放电、碳膜、吸附时间等等都要摸索出最优化的条件。

4.3.1 放电条件判断：设定一个放电的梯度，15s，20s，25s，30s，35s，40s控制其他因素不变，来摸索最优的放电条件。初步确定30s最好。

4.3.2 碳膜选择：可以对不同的GIG碳膜，quantifil碳膜(GIG)等进行试验来选择最好的。

4.3.3 蛋白吸附时间：设定一个放电的梯度，例如1s,2s,3s,4s，来摸索最优的选择是3s。

4.3.4 靶点：需要选择合适的靶点，抑制的同时不影响人RNA（找与人相同位置差距大的靶点），然后确定酶活性中心、核酸出入口、核酸进出通道等等。

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