奶牛乳房炎早期诊断试剂盒的制备及稳定性评价

文/周庆民 徐 馨* 冯万宇 张 艳 宁秀云

（1 黑龙江省兽医科学研究所；2 讷河市动物防疫站）

奶牛乳房炎是目前奶牛养殖业中危害最严重、造成损失最大的疾病之一[1～3]，严重阻碍奶牛业健康发展，危及人类食品安全[4～6]。奶牛乳房炎发病率高，发生范围广泛[7～9]。奶牛乳房炎发病初期，临床症状不明显，眼观无法判断[10～12]，但乳汁中体细胞增多，通过对乳汁中体细胞数的检测可以诊断奶牛乳房炎是否发生，做到早期发现，及时治疗[13，14]。多年以来，对奶牛乳房炎早期诊断研究很多[15～21]，相应研究出来很多方法，但都存在不足，为了更准确、更快速、更方便地诊断出早期奶牛乳房炎，进行了深入详细的研究，研制了奶牛乳房炎早期诊断试剂盒，并对其稳定性进行评价。

1 材料与方法

1.1 材料

材料：乳汁采自齐梅生物科技股份有限公司良种乳牛繁育基地。

试剂：甲基绿（购自广州威佳科技有限公司）、碘化钾（购自济南嘉裕化工有限公司）、冰醋酸（购自天津市恒兴化学试剂制造有限公司）、醋酸钠（购自南方医科大学试剂中心）。

1.2 试剂盒的制备

1.2.1 裂解液的制备

配置5 mol/L的碘化钾（KI）溶液作为细胞裂解液，直接、快速裂解体细胞及其核膜，释放DNA。

1.2.2 染色液的制备

醋酸盐缓冲液（pH值4.8）：取冰醋酸2.4 mL，醋酸钠8.16 g，溶解于498 mL蒸馏水，配置成0.2 mol/L的醋酸盐缓冲液。

甲基绿染色液的制备：取上述醋酸盐缓冲液400 mL，加入精密称取的甲基绿粉末8 g，充分溶解，配置成2%甲基绿染色液。

1.2.3 检测方法

以移液枪吸取待检奶牛乳汁样品50 μL，加入100 μL KI裂解液，静置2 min后加入甲基绿染色液，3 min后比对比色卡，根据待检样品颜色判定奶牛体细胞数目。

1.2.4 判断结果

依照1.2.3检测方法操作后，对乳样进行结果判定，判定结果见表1。

1.2.5 试剂盒的保存期检测

将同一批次制备的奶牛乳房炎早期诊断试剂盒39 个，各取半数分别置于4 ℃和室温状态下保存，每月分别取1 个试剂盒，对己知阴性（－）、弱阳性（+）和强阳性（+++）乳汁样品进行判定，以确定试剂盒的最佳保存条件和保存期限。

1.2.6 试剂盒的可重复性（稳定性）试验

取8 种不同批次（批号分别为160211、160311、160411、160511、160611、160711、160811、160911）的密闭试剂盒各两盒，对己知阴性（－）、弱阳性（+）和强阳性（+++）乳汁样品进行检测，验证同批次（批内）和不同批次（批间）制备的试剂盒判定的试验结果是否具有可重复性（稳定性）。

表1 判定结果

表2 保存期检测试验结果

2 结果与分析

2.1 保存期检测试验结果

试验的0、30、60、90、120、150、180、210、240、270、300、330、360 天分别取同一批次同时保存的密封试剂盒，对己知阴性（－）、弱阳性（+）和强阳性（+++）乳汁样品进行检测，判定的试验结果与已知阴性、阳性比对，结果见表2。由表可知，无论室温还是4℃保存的试剂盒360 天内试验结果准确，故而保质期定为1 年。

2.2 稳定性检测试验结果

取批次160211、160311、160411、160511、160611、160711、160811、160911的密闭试剂盒各两盒，对己知阴性（－）、弱阳性（+）和强阳性（+++）乳汁样品进行检测，判定的试验结果与已知阴性、阳性比对，结果见表3。由表可知，无论相同批次还是不同批次的试剂盒保质期内试验结果均准确，说明该试剂盒检测结果可重复，试剂盒稳定性较高。

3 讨论

3.1 甲基绿对DNA能够染色，其染色后显色的程度反映出DNA的量，DNA的量又反映出乳汁中体细胞的数量，乳汁中体细胞的数量又反映出奶牛乳房炎发生的程度，因此，本试验甲基绿染色的颜色也会由浅到深变化，这样可以根据颜色变化程度而判断乳汁中体细胞数量范围，以及奶牛乳房炎发生程度。

3.2 KI溶液是一种常用化学试剂，很稳定；甲基绿在醋酸盐缓冲液作用下，也十分稳定，因此，这两种诊断液可长时间保存并保持稳定，其对奶牛乳汁中体细胞的DNA作用稳定，在4 ℃或室温状态下长期保存判断结果一致。

4 结论

奶牛乳房炎早期诊断试剂盒的制备原理，是以KI裂解乳汁中体细胞细胞膜及其核膜，释放出DNA，然后利用甲基绿染料对DNA进行染色，通过染色后显色的绿色深浅正反馈DNA含量的多少，从而反映乳汁中体细胞数量的多少，进而快速判定出奶牛乳房炎发生的程度。

表3 稳定性检测试验结果（n=2）

试剂盒操作简便、判定迅速，5 min即可判断出结果；便于携带和现场应用，为检测和防控乳房炎提供了一种新的方法和手段。另外，该试剂盒保质期长，稳定性好。通过4 ℃和常温条件下的长期保存，证实该试剂盒判定结果与已知样品一致，且4 ℃和常温下均可保质1 年以上。

以碘化钾法直接裂解体细胞DNA，快速、简便、经济、高效。但应注意裂解后必须及时染色和判定，因为时间过长会容易引起DNA降解。因此裂解后要及时染色和判定，避免时间过长影响试验结果，导致样品染色颜色偏浅，造成假阴性和严重程度误判。

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