p57KIP2、cyclin D1、cyclin E在男性乳腺癌组织中的表达及其临床意义

罗祖强 庄志泉 董为松 涂晓萌

男性乳腺癌（male breast cancer，MBC）组织学类型较多，其中以浸润性导管癌最为常见。目前我国MBC的发病率约为1/20万，占全部乳腺癌患者的1%～2%。近年来，由于生活环境等因素的改变，发病率有所上升，而发病机制至今未明［1］。众所周知，正常细胞分裂、复制是在正常的细胞周期调控下完成的，细胞周期调控由细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin dependent kinase，CDK）-细胞周期蛋白（cell cycle protein，cyclin）-细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（cyclin dependent kinase inhibitors，CKI）构成。细胞周期调控异常，可导致肿瘤的形成。p57KIP2是CKI中的一员，发挥负向调控细胞周期的作用。研究显示，p57KIP2异常表达是促进肿瘤形成的原因之一［2］。cyclin促进细胞通过G1/S期限制点，加速细胞的增殖。cyclin D1、cyclin E是cyclin家族中的重要成员。关于p57KIP2在MBC中的表达及其与cyclin D1、cyclin E的相互关系尚缺乏相关报道。本研究旨在探讨p57KIP2、cyclin D1、cyclin E与MBC的发病及预后的关系，以期为MBC早期诊断及分子靶向治疗提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源 收集2000年1月至2016年12月60例温州医科大学附属第一医院MBC患者的组织标本，分为乳腺浸润性导管癌组（infiltrating ductal carcinoma，IDC）40例、乳腺导管原位癌组（ductal carcinomain situ，DCIS）20例，选取20例男性乳腺发育症（gynecomastia，GYM）作为对照组。根据AJCC癌症分期手册（第7版）中的TNM分期［3］，40例IDC分为Ⅰ期10例、Ⅱ期16例、Ⅲ+Ⅳ期14例；根据WHO标准（2003年）中的组织学分级，40例IDC分为Ⅰ级9例、Ⅱ级22例、Ⅲ级9例。患者年龄为30～72岁，中位年龄51岁，术前均未行放、化疗等治疗。所有手术切除标本留取部分新鲜标本存入液氮中备用，其余标本经10%福尔马林固定，石蜡包埋。

1.1.2 试剂 PCR引物购自上海生工公司、反转录试剂盒购自北京TaKaRa公司，p57KIP2、cyclin D1、cyclin E抗体、EliVision试剂盒及其他试剂均购自福州迈新公司。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR检测 提取细胞总RNA，检测p57KIP2、cyclin D1、cyclin E mRNA表达。反转录条件为37℃15 min，85℃5 s。取10 μL扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，EB显色，采用凝胶成像处理系统对PCR产物电泳条带积分光密度值进行分析，以p57KIP2、cyclin D1和cyclin E的PCR产物测定值与β-actin测定值的比值表示mRNA的相对表达水平，引物序列见表1。

1.2.2 免疫组织化学法检测 将石蜡4 μm厚连续切片，EliVision法检测p57KIP2、cyclin D1、cyclin E蛋白的表达。使用阳性切片作阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。p57KIP2、cyclin D1、cyclin E蛋白阳性表达于细胞核，为棕褐色或棕黄色。免疫组织化学法检测结果判断参考郭娜娜等［4］报道的方法，根据阳性细胞百分比分为无阳性细胞为0分，≤25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。按着色强度分为无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞百分比积分与着色强度积分相加，0～1分为（－），2分为（+），3～4分为（++），＞5分为（+++），其中（+）～（+++）为阳性、（－）为阴性。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计量资料多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；计数资料采用χ2检验及Spearman相关分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-PCR检测IDC、DCIS及GYM组织中p57KIP2、cyclin D1、cyclin E mRNA的表达

p57KIP2mRNA表达水平在三组间及两两间比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；cyclin D1和cyclin E mRNA表达水平均在IDC中最高、在GYM中最低，差异均具有统计学意义（P＜0.05，表2）。

2.2 免疫组织化学法检测IDC、DCIS及GYM组织中p57KIP2、cyclin D1、cyclin E蛋白的表达

p57KIP2蛋白在GYM中表达最高，在IDC中表达最低，三组间及两两间比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05，图1A、B）；cyclin D1和cyclin E蛋白在IDC中表达最高，在GYM中表达最低，IDC与GYM、DCIS与GYM比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05，图1C、D，表3）。

表1 p57KIP2、cyclin D1、cyclin E引物序列及扩增产物大小

表2 RT-PCR检测p57KIP2、cyclin D1、cyclin E mRNA在IDC、DCIS及GYM中的表达 （x±s）

表3 免疫组织化学法检测p57KIP2、cyclin D1、cyclin E蛋白在IDC、DCIS及GYM中的表达

图1 p57KIP2、cyclin D1和cyclin E蛋白在IDC和GYM中的表达 （EliVision法×200）

2.3 IDC组织中p57KIP2、cyclin D1、cyclin E蛋白表达与临床病理特征的关系

在IDC组织中p57KIP2蛋白的表达随着临床分期、组织学分级的增高而逐渐降低（P＜0.05）；cyclin D1、 cyclin E蛋白的表达随着临床分期、组织学分级的增高而逐渐升高（P＜0.05）。p57KIP2蛋白在淋巴结转移阴性组中表达高，在淋巴结转移阳性组中表达低，差异具有统计学意义（P＜0.05，表4）。

表4 p57KIP2、cyclin D1、cyclin E蛋白在IDC组织中表达与临床病理特征的关系

表4 p57KIP2、cyclin D1、cyclin E蛋白在IDC组织中表达与临床病理特征的关系（续表4）

2.4 IDC组织中p57KIP2、cyclin D1、cyclin E蛋白表达的相关性

在IDC中，p57KIP2与cyclin D1表达呈负相关（χ2= 28.571，r=-0.738，P＜0.05）；p57KIP2与cyclin E表达呈负相关（χ2=25.322，r=-0.546，P＜0.05）；cyclin D1与cyclin E表达呈正相关（χ2=8.414，r=0.235，P＜0.05）。

3 讨论

肿瘤形成是多因素、多步骤的过程，是细胞增殖调控发生严重紊乱的结果。p57KIP2是CIP/KIP家族的成员，1995年由Matsuoka等［5］发现，位于染色体11p l5.5上，能阻滞细胞周期从G1期进入S期。研究发现，肿瘤中存在p57KIP2基因的异常表达［6-7］。Guo等［8］研究显示，p57KIP2mRNA、蛋白在肝癌组织中的表达比正常肝组织低，下调肝癌细胞中p57KIP2基因的表达，能使肿瘤细胞的增殖、侵袭能力增强。Yang等［9］研究显示，p57KIP2蛋白在女性乳腺癌组织中低表达，p57KIP2表达与组织学分级、淋巴结转移有关，在女性乳腺癌细胞实验中，p57KIP2也能抑制肿瘤细胞的无限增殖。本研究结果显示，在IDC、DCIS、GYM组织中，p57KIP2mRNA及蛋白的表达均在GYM中最高，在IDC中最低，三组间及两两间比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。在IDC组织中，p57KIP2蛋白的表达随着IDC临床分期、组织学分级的增高而逐渐降低（P＜0.05）；p57KIP2蛋白在淋巴结转移阴性组中表达高，在淋巴结转移阳性组中表达低，差异具有统计学意义（P＜0.05），这与其他女性乳腺癌研究中的结果相似［9-10］。本研究提示，在正常男性乳腺细胞中，转录、翻译两个水平中存在p57KIP2高表达，使细胞周期阻滞在G0期，当致癌因子使p57KIP2低表达时，可能解除了对细胞生长的抑制，导致细胞恶变。因此，p57KIP2蛋白可以作为临床判断MBC预后的重要指标之一。

cyclin D1基因位于11q13，cyclin D1蛋白包含295个氨基酸，cyclin D1与CDK4和CDK6结合，引起Rb的超磷酸化，从而促进细胞增殖。Ahlin等［11］研究发现，cyclin D1蛋白高表达能促进女性乳腺癌细胞的增殖，促进乳腺癌的发生发展，是乳腺癌预后的指标之一。cyclin E基因位于19q12～13，cyclin E蛋白包含395个氨基酸，cyclin E与CDK2结合，在细胞进入S期前显示出短暂而强烈的酶活性，并引起Rb磷酸化，启动DNA合成。Lucenay等［12］研究发现，cyclin E蛋白高表达促进了女性乳腺癌的侵袭与转移，是乳腺癌恶性转变的重要标志。目前，已有cyclin D1、cyclin E在女性乳腺癌中表达的研究，但cyclin D1、cyclin E在男性IDC中的表达情况尚不清楚。IDC的病因至今未明，研究认为可能与细胞周期调控紊乱等多种因素有关［13］。本研究结果显示，cyclin D1和cyclin E mRNA及蛋白的表达均在IDC中最高、在GYM中最低，IDC与GYM、DCIS与GYM比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05），与女性乳腺癌研究中的结果［11-12］相似。cyclin D1与cyclin E在IDC组织中的表达呈正相关（P＜0.05），提示正常男性乳腺组织细胞中，cyclin D1、cyclin E在转录、翻译的较低水平表达是男性乳腺细胞保持正常沉默状态所必须的前提条件，如异常高表达，则可导致肿瘤的发生。cyclin D1、cyclin E可作为临床判断MBC预后的重要指标。

细胞周期调控紊乱是肿瘤细胞无限增殖的重要原因。本研究结果显示，p57KIP2mRNA及蛋白的表达在GYM中最高，在IDC中表达最低，cyclin D1、cyclin E mRNA及蛋白的表达均在IDC中最高、在GYM中最低，p57KIP2与cyclin D1、p57KIP2与cyclin E呈负相关，cyclin D1与cyclin E呈正相关。本研究提示，在正常男性乳腺组织中p57KIP2高表达，p57KIP2蛋白结构的氨基端介导对CDK激酶活性的抑制，p57KIP2蛋白通过与cyclin E、cyclin D-CDK4等复合物结合，抑制复合物对Rb蛋白的磷酸化作用，使细胞周期无法完成由G1期向S期的转变，使细胞停滞在G1期，从而对细胞周期进行负性调控。IDC组织中可能由于p57KIP2基因活性下调，使p57KIP2蛋白低表达，cyclin D1和cyclin E基因活性上调，促进cyclin D1、cyclin E蛋白的表达，削弱了p57KIP2抑制cyclin D1、cyclin E的作用，使细胞无限增殖。

综上所述，p57KIP2、cyclin D1、cyclin E可能参与了MBC的发生发展过程，联合检测p57KIP2、cyclin D1、cyclin E对进一步发现MBC的发病机制及治疗提供重要参考。

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