中药心康方对大鼠心力衰竭模型心肌胶原代谢的影响

叶小汉 吕洪雪 吴锦波

523000 东莞市中医院心内科

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)及其组织抑制因子(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMP)是胶原代谢的重要调节因子[1]。中药心康方功能宣肺平喘、降气利水、益气活血，能改善慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)患者心功能、降低N末端B型利钠肽原(N-terminal pro B-type natriuretic peptide，NT-proBNP)、增加6 min步行距离、提高生活质量[2]；可降低心脏MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2的基因表达水平，降低胶原容积分数(collagen volume fraction，CVF)，但其机制尚不清楚[3]。本研究通过复制大鼠心力衰竭模型，观察中药心康方对CHF大鼠胶原代谢的影响，进一步探讨中药心康方的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康雄性6周龄[体重(240±15)g] Sprague Dawley(SD)大鼠60只，由广州中医药大学动物实验中心提供，动物许可证号：SCXK(粤)2013-0020，动物合格证号：NO.440059000。SPF级净化空间，生长条件为12 h/12 h光照周期，温度(22±3)℃，相对湿度40%～70%，自由摄食、饮水。

1.1.2 药物与试剂 按实验动物与人体表面积比例进行药物剂量换算，大鼠中药剂量采用换算剂量的2倍。中药心康方由葶苈子15 g、杏仁10 g、茯苓15 g、黄芪15 g、陈皮5 g、三菱10 g组成，中药饮片购自东莞市药材公司，由东莞市中医院制成流浸膏，并浓缩至0.13g生药/ml，-20℃保存。

卡托普利(中美上海施贵宝)；阿霉素(Medchemexpress LLC)；氯胺酮(福建古田药业)；地西泮(天津金耀药业)；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)试剂盒(碧云天)；抗β-actin、Lamin B、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、转化生长因子β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)、核因子κB的抑制蛋白(inhibitor of nuclear factor kappa B，IκB)、p56、MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2抗体(Abcam)；增强型化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)显色液(美国Millipore)；Bestar qPCR RT Kit(德国DBI)。

1.1.3 主要仪器 HP5500心脏超声仪(美国惠普)；GDS7600凝胶扫描系统(英国UVP)；Agilent Stratagene PCR仪Mx3000P(美国安捷伦)。

1.2 方法

1.2.1 动物造模和分组[4]雄性SD大鼠适应性喂养1周后，采用阿霉素腹腔注射法(用灭菌注射用水溶解成0.25 mg/ml溶液，每次注射剂量为2.5 mg/kg，2周内分6次注射，总剂量15 mg/kg)建立大鼠心力衰竭模型。首次腹腔注射5周后超声心动图检测左心室短轴缩短率(fractional shortening，FS)，以心腔扩大，FS<30%作为心力衰竭成模标准。从60只大鼠中随机选取10只作为对照组，予腹腔注射10 ml/kg生理盐水；其余50只大鼠用于造模，将造模成功的大鼠按随机数字表法分为模型组、心康方组和卡托普利组，分别以蒸馏水(10 ml/kg)、心康方中药浸膏(10 ml·kg-1·d-1)和卡托普利(13.5 mg·kg-1·d-1)灌胃，每天1次，连续35 d。

1.2.2 大鼠心功能和左室重构指标的检测 分别于第6周(干预前)和第12周(干预后)采用腹腔注射氯胺酮(50 mg/kg)和地西泮(5 mg/kg)混合麻醉大鼠，超声心动图测量左室舒张末期容积(left ventricular end-diastolic volume，LVEDV)、左室收缩末期容积(left ventricular end-systolic volume，LVESV)、心排血量(cardiac output，CO)、FS和左心室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)。并于第12周超声心动图检查后，立即注射2 mmol/L氯化钾，使大鼠心脏停搏在舒张末期，迅速开胸离断心脏，PBS冲洗干净后，显微解剖分离左心室，称重，计算左心室质量指数(left ventricular mass index，LVMI)。

1.2.3 Masson染色检测心肌胶原沉积 取大鼠心室组织常规固定，石蜡包埋、切片；脱蜡，Wayer苏木素染5 min；丽春红酸性品红液染5 min；1%磷钼酸水溶液处理5 min；苯胺蓝液复染1 min。应用IPP 6.0病理图像分析软件分析各组胶原纤维表达，计算CVF(CVF=胶原面积/总面积)。

1.2.4 Western blot检测心肌Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、TGF-β1、IκB、p56、MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2的表达 取心肌组织冰上裂解1 h，提取细胞内蛋白，BCA法蛋白定量。取各组蛋白样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后用牛血清蛋白封闭，经Ⅰ抗结合后洗膜，Ⅱ抗结合，洗膜后ECL显色，软件分析。以Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、TGF-β1、IκB、MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2的平均灰度值与相应内参照蛋白β-actin的平均灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达量，p56的内参照蛋白为Lamin B。

1.2.5 RT-qPCR检测心肌MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2的mRNA表达 心肌组织匀浆后，Trizol法抽提总RNA，Agilent Stratagene PCR仪Mx3000P进行实时荧光定量PCR。PCR反应条件为反转录94℃灭活反转录酶和预变性2 min，94℃变性20 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，PCR扩增40循环。以β-actin作为内参基因，采用2-△△Ct公式计算mRNA的相对表达水平。引物设计及PCR反应均由广州维伯鑫生物科技有限公司完成。PCR引物见表1。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 一般情况

采用阿霉素腹腔注射法造模共50只，造模过程中有15只大鼠因出现重度心力衰竭和肝硬化腹水而死亡，死亡率为30.0%；FS不达标5只，成模率为60.0%。30只造模成功大鼠按随机数字表法分成3组：模型组、心康方组和卡托普利组，每组10只，在随后的实验干预中，每组各有1只大鼠因灌胃不当而死亡。CHF大鼠出现不同程度的食欲减退、精神较差、张口呼吸和乏力等症状。干预前，各组成模大鼠平均体重和FS差异均无统计学意义(均为P>0.05)；对照组大鼠平均体重和FS均高于各造模组(均为P<0.01)，见表2。

表1 RT-qPCR引物序列

表2 各组大鼠体重和FS比较

注：与对照组比较，aP<0.01

2.2 大鼠心功能和左室重构指标

干预后，模型组大鼠的FS、CO和LVEF显著低于对照组，LVEDV、LVESV和LVMI显著高于对照组(均为P<0.01)；心康方组和卡托普利组的FS、CO和LVEF显著高于模型组(均为P<0.01)，LVEDV、LVESV和LVMI显著低于模型组(均为P<0.01)，见表3。

2.3 大鼠心肌CVF和心肌Ⅰ型、Ⅲ型胶原的表达

表3 各组大鼠心功能和左室重构指标的比较

注：与对照组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.01

光镜下观察，Masson染色中胶原纤维呈蓝白色，胞质、肌纤维呈红色，胞核蓝褐色。与对照组(0.08%±0.02%)比较，模型组(0.27%±0.11%)CVF增加了237.50%；与模型组比较，心康方组(0.18%±0.04%)和卡托普利组(0.15%±0.09%)CVF分别降低了31.03%和44.44%(P<0.05或P<0.01)(图1)。模型组Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原显著高于对照组，心康方组和卡托普利组Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原显著低于模型组，差异均有统计学意义(均为P<0.01)。

2.4 大鼠心肌TGF-β1、IκB和p56的表达

模型组TGF-β1和p56显著高于对照组，IκB显著低于对照组；心康方组和卡托普利组TGF-β1和p56显著低于模型组，IκB显著高于模型组，差异均有统计学意义(均为P<0.05)，见图2。

2.5 大鼠心肌MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2 蛋白含量和mRNA的相对表达量

模型组MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2的蛋白含量和mRNA相对表达量显著高于对照组(P<0.01或P<0.05)；心康方组和卡托普利组MMP-2、 MMP-9、TIMP-1和TIMP-2 的蛋白含量和mRNA相对表达量显著低于模型组(P<0.01或P<0.05)，差异均有统计学意义，见图3～6。各组MMP-2/TIMP-2蛋白比值差异无统计学意义；模型组、心康方组和卡托普利组MMP-9/TIMP-1蛋白比值差异无统计学意义，均显著少于对照组(0.32±0.20、0.34±0.17和0.41±0.30比0.86±0.45，P<0.01或P<0.05)。

A：对照组；B：模型组；C：心康方组；D：卡托普利组图1 各组大鼠心肌胶原组织Masson染色(×200)

与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05图2 各组大鼠心肌Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、TGF-β1、IκB和p56的相对表达

与对照组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.01图3 大鼠心肌MMP-2蛋白和mRNA的相对表达量

与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05图4 大鼠心肌MMP-9蛋白和mRNA的相对表达量

与对照组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.01图5 大鼠心肌TIMP-1蛋白和mRNA的相对表达量

与对照组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.01图6 大鼠心肌TIMP-2蛋白和mRNA的相对表达量

3 讨论

本研究通过腹腔注射阿霉素建立CHF大鼠模型，Masson染色结果表明CHF大鼠发生心肌纤维化(myocardial fibrosis，MF)，而心康方组的纤维化程度显著低于模型组。蛋白印迹试验结果发现CHF大鼠心肌Ⅰ型和Ⅲ型胶原过度沉积，而心康方组和卡托普利组的胶原沉积显著少于模型组，表明中药心康方和卡托普利可以改善心肌胶原代谢，具有抗MF作用。

心肌组织的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)是由Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、原纤维蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖和糖蛋白等物质在心肌细胞附近形成的网架结构[5]。胶原是心脏ECM中含量最多的物质，其中85%是Ⅰ型胶原，11%为Ⅲ型胶原。心肌胶原合成与降解失衡，导致胶原比例改变及过度沉积而形成MF[6]。TGF-β1是与胶原代谢关系最密切的细胞因子[7]，可诱导成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，合成和分泌大量ECM(主要是Ⅰ型和Ⅲ型胶原)。肌成纤维细胞合成ECM的能力远大于成纤维细胞，是组织纤维化过程中产生过量ECM的主要来源细胞。肌成纤维细胞可迁移至损伤区域并迅速增殖，合成大量ECM，促进ECM间的交联，引起胶原的过度沉积，导致MF发生。本实验中，CHF大鼠心肌TGF-β1表达水平显著升高，胶原代谢紊乱，左室出现病理性重构，提示ECM重构；心康方组TGF-β1表达水平显著低于模型组，提示胶原代谢得到改善，ECM重构减轻。TGF-β1还可抑制MMPs分泌，刺激TIMPs表达，抑制胶原降解[7]。成纤维细胞产生MMPs和TIMPs，MMPs降解ECM，TIMPs抑制MMPs从而抑制ECM降解。其中，MMP-2和MMP-9能降解心肌胶原，TIMP-2能抑制MMP-2活性，TIMP-1能抑制MMP-9活性。本实验中，CHF大鼠心肌MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2的蛋白和mRNA表达水平均显著升高，提示胶原降解加快，TIMPs加强对MMPs的抑制作用；心康方组MMPs和TIMPs的蛋白和mRNA表达水平均显著低于模型组，提示胶原降解减慢，TIMPs对MMPs的抑制作用减轻；心康方组与模型组MMPs/TIMPs比值无显著差异，可能与检测时间点过晚有关：当ECM重构到达一定程度，MMPs与TIMPs形成新的短暂的动态平衡，ECM降解与合成相对稳定。

研究发现NF-κB可介导TGF-β1上调而促进MF，抑制NF-κB的表达可下调TGF-β1的表达，从而减轻MF[1]；应用该理论可以较好地解析我们的实验结果。p65/p50是NF-κB的常见存在形式，IκB是其抑制因子；IκB可被磷酸化降解，p65磷酸化激活而实现NF-κB的功能。本实验中，CHF大鼠心肌p56显著升高，IκB显著降低，提示NF-κB介导TGF-β1上调而促进MF；心康方组p56显著低于模型组，IκB显著高于模型组，提示中药心康方能抑制NF-κB通路，抑制TGF-β1上调而减轻MF。另外，抑制成纤维细胞中NF-κB通路还可以减少Ⅰ型胶原累积，减轻MF[8]。作为阳性对照的卡托普利早已被证实具有抗MF作用，能降低TGF-β1水平[9-10]，与本研究结果一致。

MF是CHF左室重构的主要表现，减轻MF可以抑制病理性左室重构，改善心功能。胶原代谢紊乱导致MF，改善胶原代谢可以减轻MF。胶原的合成、分泌和降解都受到机体的严密调控。中药心康方在阿霉素诱导的CHF大鼠模型中能够抑制NF-κB和TGF-β1通路，通过调节MMPs、TIMPs、Ⅰ型和Ⅲ型胶原的表达而减少胶原沉积，减轻MF。TGF-β1通路在胶原代谢中的作用已经比较明确，NF-κB在MF中的作用及其机制仍未达成共识，有待进一步研究。

由于本实验动物样本量少，使用的是小动物，只针对阿霉素诱导的特定HF模型，实验中药的效应及其具体作用机制有待进一步的研究来验证和解答。

利益冲突：无

[1] 李秀，韩科强，石亚男，等.熊去氧胆酸对异丙肾上腺素诱导的小鼠心肌纤维化的作用[J].中华医学杂志，2017，97(5)：387-391.DOI：10.3760/cma.J.issn.0376-2491.2017.05.013.

Li X，Han KQ，Shi YN，et al.Effects and mechanisms of ursodeoxycholic acid on isoprenaline-induced myocardial fibrosis in mice [J].Natl Med J China，2017，97(5)：387-391.DOI：10.3760/cma.J.issn.0376-2491.2017.05.013.

[2] 苏志远，叶小汉，吴锦波.心康方治疗慢性心力衰竭临床观察[J].新中医，2016，48(3)：12-14.DOI：10.13457/j.cnki.Jncm.2016.03.005.

Su ZY，Ye XH，Wu JB.Clinical observation of Xinkang recipe in the treatment of patients with chronic heart failure [J].Journal of New Chinese Medicine，2016，48(3)：12-14.DOI：10.13457/j.cnki.Jncm.2016.03.005.

[3] 吴锦波，叶小汉，冼绍祥，等.泻肺利水中药对心力衰竭大鼠左室重构的影响[J].西安交通大学学报(医学版)，2017，38(1)：136-141，156.DOI：10.7652/j dyxb201701029.

Wu JB，Ye XH，Xian SX，et al.Effects of Xiefei Lishui recipe on left ventricle remodeling in rats with heart failure [J].Journal of Xi′an Jiaotong University(Medical Sciences)，2017，38(1)：136-141，156.DOI：10.7652/j dyxb201701029.

[4] 白剑，顾蓉，王丙剑，等.过表达整合素连接激酶可改善慢性心力衰竭大鼠心功能 [J].中华心血管病杂志，2014，42(3)：225-229．DOI：10.3760/cma.J.issn.0253-3758.2014.03.010.

Bai J，Gu R，Wang BJ，et al.Overexpression of integrin-linked kinase improves cardiac function in a rat model of doxorubicin-induced chronic heart failure [J].Chin J Cardiol，2014，42(3)：225-229.DOI：10.3760/cma.J.issn.0253-3758.2014.03.010.

[5] 张蓓蓓，蔡辉.心脏肌成纤维细胞活化的力学调控 [J].中国心血管杂志，2016，21(6)：500-504.DOI：10.3969/J.issn.1007-5410.2016.06.017.

Zhang BB，Cai H.Mechanical regulation of cardiac myofibroblast activation [J].Chin J Cardiovasc Med，2016，21(6)：500-504.DOI：10.3969/J.issn.1007-5410.2016.06.017.

[6] 吕仕超，张军平，李萌，等.压力超负荷大鼠心肌胶原代谢的动态变化 [J].中国病理生理杂志，2017，33(4)：740-743.DOI：10.3969/j.issn.1000-4718.2017.04.027.

Lyu SC，Zhang JP，Li M，et al.Dynamic changes of myocardial collagen metabolism in pressure-overloaded rats [J].Chinese Journal of Pathophysiology，2017，33(4)：740-743.DOI：10.3969/j.issn.1000-4718.2017.04.027.

[7] Xu F，Liu C，Zhou D，et al.TGF-/SMAD Pathway and its regulation in hepatic fibrosis [J]．J Histochem Cytochem，2016，64(3)：157-167.DOI：10.1369/0022155415627681.

[8] Makino S，Mitsutake N，Nakashima M，et al.DHMEQ，a novel NF-kappaB inhibitor，suppresses growth and type I collagen accumulation in keloid fibroblasts [J].J Dermatol Sci，2008，51(3)：171-180.DOI：10.1016/j.jdermsci.2008.03.003.

[9] Sayer G，Bhat G.The renin-angiotensin-aldosterone system and heart failure [J].Cardiol Clin，2014，32(1)：21-32.DOI：10.1016/j.ccl.2013.09.002.

[10] Sun R，Wang J，Zheng Y，et al.Traditional Chinese medicine baoxin decoction improves cardiac fibrosis of rats with dilated cardiomyopathy [J].Exp Ther Med，2017，13(5)：1900-1906.DOI：10.3892/etm.2017.4223.