诱导型一氧化氮合酶基因多态性与冠心病的关联性研究

韩京军 张艳炜 伍德强 张磊 张晶

518033 深圳，中山大学附属第八医院心胸外科(韩京军、伍德强、张磊、张晶)；518055深圳市疾病预防控制中心分子生物医学检验科(张艳炜)

《全球疾病负担报告2013》显示，1990—2013 年高收入地区的心血管疾病病死率下降了22%[1]。《中国心血管病报告2016》显示，中国心血管病(包括冠心病和脑血管病)现患人数已高达2.9亿，心血管病占居民疾病死亡构成的40%以上，为我国居民的首位死因。其中冠心病是受环境因素和遗传因素相互作用、发病机制十分复杂的多基因疾病[2-3]。一氧化氮(nitric oxide，NO)作为一种信号因子，可以通过调节血管舒张收缩反应、参与机体炎症反应和介导神经信号转导等过程，直接或间接地影响动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的发生与发展。人体内存在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)基因的3种亚型，其中诱导型NOS(inducible nitric oxide synthase，iNOS)催化释放的NO自由基可引起血管内皮损伤、促进血管壁炎症反应，在AS发生与发展的调节机制中起着重要的作用[4]。目前为止，国内外均较少见到有关iNOS基因多态性与冠心病关联性的研究报道。本研究主要针对iNOS基因的2个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)与冠心病的关联进行初步探讨。

1 对象和方法

1.1 研究对象

病例组291例来源于2015 年6月至2017 年2月中山大学附属第八医院心脏中心住院的汉族冠心病患者。入选标准：符合世界卫生组织临床命名的《缺血性心脏病的命名及诊断标准》，即冠状动脉造影结果显示在主要冠状动脉血管中，至少存在1支血管内径狭窄超过50%。对照组487名来自于同期年龄、性别匹配的门诊健康体检者，经询问病史、问卷调查、心脏核素扫描、CT冠状动脉成像或冠状动脉造影等检查排除冠心病。所有研究对象均无任何血缘关系，排除心肌病、脑血管病、肺源性心脏病、风湿性心脏病、先天性心脏病、充血性心力衰竭、周围血管性疾病、肝肾疾病及其他恶性肿瘤。

1.2 资料收集

采用病例-对照研究设计方案。通过统一的自制调查问卷对入选的研究对象进行调查，调查内容主要包括：年龄、性别、体重、身高、民族、籍贯、是否吸烟、是否喝酒，是否患有高血压、糖尿病、高脂血症，是否有冠心病家族史等。

高血压诊断标准：收缩压≥140 mmHg和(或)舒张压≥90 mmHg或目前正在服用降压药。糖尿病诊断标准：空腹血糖≥7.0 mmol/L，或目前正在服用降糖药。高脂血症诊断标准：三酰甘油(triglyceride，TG)>1.70 mmol/L，总胆固醇(total cholesterol，TC)>5.72 mmol/L，或目前正在服用降脂药。

调查过程中所有研究对象均签署知情同意书，并由经过培训的专业人员通过询问患者家属及之前的诊查记录等方法进行数据质控。通过病案系统调取患者和健康体检者血液检查结果，包括TG、TC、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、空腹血糖、尿酸等。本研究通过中山大学附属第八医院医学伦理委员会的批准(2016-420)。

1.3 iNOS基因多态性检测

所有受检者空腹12～15 h，于次日晨8：00时抽取外周静脉血3 ml，置于5 ml的EDTA抗凝管中混匀，4℃冰箱保存不超过12 h，离心分装于1.5 ml EP管中，编码保存于-80℃冰箱，准备提取DNA。用AXYGEN公司的全血基因组DNA提取试剂盒抽提DNA；其后用核酸检测仪检测其浓度和纯度。DNA存放于-80℃冰箱。

采用Taqman探针法对iNOS基因的rs2779248、rs1137933的基因型进行检测，预期扩增片段在150 bp左右。位点的上、下引物和探针均由美国ABI公司合成，序列见表1。反应体系为：2×TIANtough Genotyping PreMix 10 μl，40×Taq Man SNP Genotyping Assays 0.5 μl，50×ROXReferece Dye 0.4 μl，Rnase-Free ddH2O 7.1 μl，模版DNA 2 μl 组成。在ABI Step One Plus荧光PCR仪上执行如下程序：60℃ 30 s，95℃ 2 min，95℃ 20 s， 60℃ 32 s共40个循环，最后60℃ 30 s结果判定。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 一般情况

病例组共纳入291例汉族冠心病患者，其中男性203例，占69.8%，平均年龄(59.9±10.2)岁；对照组共纳入487名健康体检者，其中男性354例，占72.7%，平均年龄(59.2±10.1)岁。病例组和对照组的年龄、性别差异无统计学意义。与对照组比较，病例组的高血压、糖尿病、高脂血症的比例明显升高，而饮酒比例则降低，差异均有统计学意义(均为P<0.01)。与对照组比较，病例组的TG、TC、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇均降低，而血糖和血尿酸水平均升高，差异均有统计学意义(均为P<0.05)，见表2。

2.2 遗传平衡检验

两组rs2779248、rs1137933的基因型分布频率见表3、4。将对照组的iNOS各基因型频率代入Hardy-Weinberg遗传平衡定律，进行群体代表性检验，结果显示iNOS各基因型频率与期望值基本吻合，χ2值分别为0.803和0.013，P>0.05。这两个SNP的基因型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。

2.3 SNP基因型频率分布及其与冠心病的关联性

表1 研究位点的引物和探针

表2 研究对象一般人口特征和相关因素分布

注：TG：三酰甘油；TC：总胆固醇；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇

表3 rs2779248基因型及等位基因的分布

注：MAF：最小等位基因频率

rs2779248 T等位基因分布频率病例组(20.45%)高于对照组(18.69%)，但差异无统计学意义。与CC基因型相比，CT基因型携带者的冠心病发病风险增加1.08倍(95%CI：0.79～1.48)，TT基因型携带者可以增加1.75倍的发病风险(95%CI：0.82～3.76)，CT+TT基因型携带者发病风险增加1.14倍(95%CI：0.84～1.54)，但差异均无统计学意义，见表3。

rs1137933 T等位基因分布频率病例组(20.45%)明显高于对照组(15.91%)，T等位基因携带者冠心病发病风险增加1.36倍(95%CI：1.04～1.77)，差异有统计学意义(P=0.023)。与CC基因型相比，CT基因型携带者的冠心病发病风险增加1.29倍(95%CI：0.93～1.77)，TT基因型携带者增加2.16倍(95%CI：0.98～4.76)，CT+TT基因型携带者增加1.36倍(95%CI：1.00～1.85)，但差异均无统计学意义，见表4。

2.4 多因素Logistic回归分析

以分类变量有无冠心病为应变量，将高血压、糖尿病、高脂血症、吸烟、饮酒等传统危险因素作为自变量放入多因素Logistic回归模型，发现rs2779248 TT基因型是冠心病易感危险因素(OR=2.58，95%CI：1.01～6.67，P=0.048)，见表3，而rs1137933基因多态性却未显示出这种危险关系。

2.5 各基因型间生化指标差异分析

以各位点3个不同基因型进行分组，进行生化指标差异分析。两个位点3个基因型间TG、TC、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和血尿酸差异均无统计学意义。rs2779248TT基因型携带者空腹血糖[(6.74±4.13)mmol/L]明显高于CC基因型携带者[(5.75±2.20)mmol/L]，差异有统计学意义(P=0.045)。rs1137933 TT基因型携带者空腹血糖[(7.01±4.24)mmol/L]明显高于CT基因型携带者[(5.66±1.74)mmol/L]和CC基因型携带者[(5.79±2.32)mmol/L]，P=0.009和0.015，见表5、图1。

3 讨论

本研究表明，iNOS基因rs2779248和rs1137933等位基因C>T突变与汉族人群冠心病遗传易感性有关。rs1137933 T等位基因可以增加冠心病的发病风险；在校正相关危险因素后，rs2779248 TT基因型是冠心病发生的独立危险因素。同时在比较两个位点各基因型间生化指标差异时发现，突变基因型携带者空腹血糖水平均明显高于野生基因型携带者，由此我们推测iNOS基因可能通过调控血糖而影响动脉粥样硬化斑块的形成过程，进而增加冠心病的发病风险。课题组前期在缺血性脑卒中遗传易感性的研究中发现，rs2779248和rs1137933与中国汉族人群缺血性脑卒中易感性存在显著相关性[5]，而冠心病和缺血性脑卒中有着几乎相同的病理基础和高危因素。

表4 rs1137933基因型及等位基因的分布

注：MAF：最小等位基因频率

表5 rs2779248和rs1137933各基因型间生化指标的差异分析

注：TG：三酰甘油；TC：总胆固醇；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇

图1 rs2779248和rs1137933各基因型间空腹血糖比较

iNOS由NOS2A基因编码翻译，该基因定位于第17号染色体，基因长度为37 kb，包含26个外显子和25个内含子，是由1 153个氨基酸组成的蛋白质[6]。正常情况下，NO可以通过抑制平滑肌细胞增殖、抑制血小板聚集和粘附、抑制白细胞激活和附着等作用起到预防AS发生的作用[6]。iNOS在正常的内皮细胞中表达很低，但在炎症反应或缺血缺氧、高血糖等氧化应激情况下，iNOS表达增强并合成大量的、可能产生细胞毒性的NO[7]。由iNOS诱导6～8 h后合成的NO总量是内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和神经元型一氧化氮合酶(nNOS)合成总量的几千倍[8]。过多的NO与过氧化物一起导致过氧化，引起组织损伤[9]。iNOS可能通过增加氧化应激在血管壁上形成损伤，进而加剧动脉硬化斑块的形成[10]。目前关于iNOS与冠状动脉粥样硬化相关疾病的确切发病机制并不清楚，Buttery等[11]研究显示，iNoS的tuRNA在AS血管的巨噬细胞和血管平滑肌细胞中呈高表达。万鑫等[12]研究发现，iNOS基因多态性与脑动脉粥样硬化相关。

本研究选取汉族冠心病患者和健康体检人群作为研究对象，比较分析了iNOS基因rs2779248、rs1137933两个SNP基因型及等位基因的分布，明确了iNOS基因rs2279248和rs1137933多态性与汉族人群冠心病发病风险有关，并且发现这两个位点各基因型间血糖水平存在显著差异，提示iNOS基因可能通过调控血糖进而影响冠心病的发生和发展。为进一步确定以上结论，尚需要更大的样本量进行验证，并需要更加深入的机制研究。

本研究属于病例对照研究，不可避免会存在研究对象选择偏倚问题；同时由于样本量偏少，缺少环境-遗传因素间交互作用的分析，尚需进一步深入研究。

利益冲突：无

[1] GBD 2013 Mortality and Causes of Death Collaborators.Global，regional，and national age-sex specific all-cause and cause-specific mortality for 240 causes of death，1990-2013：a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013 [J].Lancet，2015，385(9963)：117-171.DOI：10.1016/S0140-6736(14)61682-2.

[2] Minino AM.Death in the United States，2009 [J].NCHS Data Brief，2011，64：1-8.

[3] Mathers CD，Loncar D.Projections of global mortality and burden of disease from 2002 to 2030 [J].PLoS Med，2006，3(11)：e442.DOI：10.1371/journal.pmed.0030442

[4] Forstermann U，Sessa WC.Nitric oxide synthases：regulation and function [J].Eur Heart J，2012，33(7)：829-837，837a-837d.DOI：10.1093/eurheartj/ehr304.

[5] 张艳炜，韩京军，李山山，等.诱导型一氧化氮合酶基因多态性与中国汉族人群缺血性脑卒中的关联性 [J].国际脑血管病杂志，2015，23(10)：756-760.DOI：10.3760/cma.j.issn.1673-4165.2015.10.005.

Zhang YW，Han JJ，Li SS，et al.Correlation between inducible nitric oxide synthase gene polymorphism and ischemic stroke in Chinese Han population [J].Int J Cerebrovasc Dis，2015，23(10)：756-760.DOI：10.3760/cma.j.issn.1673-4165.2015.10.005.

[6] Radomski MW，Palmer RM，Moncada S.Modulation of platelet aggregation by an L-arginine-nitric oxide pathway [J].Trends Pharmacol Sci，1991，12(3)：87-88.

[7] Toda N，Okamura T.Cigarette smoking impairs nitric oxide-mediated cerebral blood flow increase：Implications for Alzheimer′s disease [J].J Pharmacol Sci，2016，131(4)：223-232.DOI：10.1016/j.jphs.2016.07.001.

[8] Puglisi MA，Cenciarelli C，Tesori V，et al.High nitric oxide production，secondary to inducible nitric oxide synthase expression，is essential for regulation of the tumour-initiating properties of colon cancer stem cells [J].J Pathol，2015，236(4)：479-490.DOI：10.1002/path.4545.

[10] Cherdantseva LA，Potapova OV，Sharkova TV，et al.Association of Helicobacter pylori and iNOS production by macrophages and lymphocytes in the gastric mucosa in chronic gastritis [J].J Immunol Res，2014：762514.DOI：10.1155/2014/762514.

[11] Ahotupa M.Oxidized lipoprotein lipids and atherosclerosis [J].Free Radic Res，2017，51(4)：439-447.DOI：10.1080/10715762.2017.1319944.

[12] Buttery LD，Springall DR，Chester AH，et al.Inducible nitric oxide synthase is present within human atherosclerotic lesions and promotes the formation and activity of peroxynitrite [J].Lab Invest，1996，75(1)：77-85.

[15] 万鑫，代成波，曹裕民，等.诱导型一氧化氮合酶基因多态性与颅内动脉粥样硬化的相关性研究 [J].中华老年心脑血管病杂志，2013，15(4)：382-385.DOI：10.3969/j.issn.1009-0126.2013.04.014.

Wan X，Dai CB，Cao YM，et al.Correlation between inducible nitric oxide synthase gene polymorphism and intracranial atherosclerosis [J].Chinese Journal of Geriatric Heart Brain and Vessel Diseases，2013，15(4)：382-385.DOI：10.3969/j.issn.1009-0126.2013.04.014