他克莫司联合保真汤加减治疗难治性肾病综合征的疗效探讨

张书锋，刘翠华，刘钧菲，李玉柳，厉洪江

(郑州大学附属儿童医院/河南省儿童医院/郑州儿童医院肾脏风湿科 450018)

难治性肾病综合征(refractory nephritic syndrome，RNS)是原发性肾病综合征的一种特殊类型，环磷酰胺是目前西医治疗RNS的首选方案之一，然而该疗法整体疗效较低、不良反应较大，且复发率较高，故难达到预期效果[1]。文献[2]报道他克莫司较环磷酰胺能提高RNS患儿的缓解率，治疗6个月时患儿的总缓解率显著提高，他克莫司治疗RNS的有效性优于环磷酰胺。越来越多的研究显示，中医药可改善RNS患儿的临床症状，减轻药物不良反应及延缓肾衰竭等作用[3]。在西医基础上应用中药干预可显著改善患儿的症状体征，提高临床疗效，且能够减少单纯西药所致的不良反应[4]。保真汤为《证治准绳》古方，具有脾肾双补、补气益阴、利湿退热等作用，既往研究报道保真汤治疗肾病综合征能够改善患儿的蛋白尿和浮肿症状，增加血清蛋白水平[5]。本组研究经悉心辨证纳入RNS脾肾阳虚证患儿，旨在进一步评估他克莫司联合保真汤加减的中西医结合优化治疗方案的有效性和安全性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2014年7月至2016年12月在本院就诊的RNS患儿104例，分为对照组(52例)和治疗组(52例)，期间对照组转院2例和资料遗失1例共完成研究49例，治疗组查出肿瘤1例和中途退出1例共完成50例。对照组(49例)：男29例，女20例；年龄5～13岁，平均(9.2±1.5)岁；病程1.0～2.3年，平均(1.3±0.2)年；初诊24 h尿蛋白3.5～17.9 g，平均6.9 g；血清清蛋白18.95～34.06 g/L，平均26.88 g/L；伴高血压者7例；病理类型：微小病变肾病8例，局灶节段性肾小球硬化症12例，膜性肾病10例，膜增生性肾小球肾炎4例，系膜增生性肾炎15例。治疗组(50例)：男31例，女19例；年龄4～14岁，平均(9.3±1.5)岁；病程1.2～2.4年，平均(1.3±0.2)年；初诊24 h尿蛋白3.4～18.2 g，平均6.9 g；血清清蛋白18.98～33.97 g/L，平均26.76 g/L；伴高血压者9例；病理类型：微小病变肾病9例，局灶节段性肾小球硬化症10例，膜性肾病11例，膜增生性肾小球肾炎3例，系膜增生性肾炎17例。两组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究获得本院伦理委员会批准通过(20140312)。

1.2诊断标准

1.2.1RNS诊断标准 依据全球肾脏病预后生存质量(KDIGO)指南[6]。患儿初始激素干预有效但复发后再次治疗无效，或标准剂量(1 mg·kg-1·d-1)激素干预8～12周后无改善效果；肾小球滤过率大于或等于60 mL·min-1·1.73 m-2。

1.2.2脾肾阳虚证诊断标准 根据《中医内科常见病诊疗指南西医疾病部分》[7]。主症：面色白光白，遍体浮肿，形寒肢冷，甚则并发腹水、胸水，胸闷，大便溏薄，小便短少，舌淡体胖，苔薄腻或白腻，脉沉细滑。

1.3纳入标准 (1)符合难治性肾病综合征诊断患儿；(2)符合中医脾肾阳虚证诊断患儿；(3)年龄5～15岁；(4)近期未服用中药患儿；(5)患儿家属签署知情同意书。

1.4排除标准 (1)过敏体质患儿；(2)依从性差患儿；(3)继发性肾病综合征患儿；(4)伴心、肺、肝及造血系统等严重疾病患儿。

1.5治疗方法 基础治疗：采用优质限蛋白、低脂、低盐饮食，并根据病情予以控制血压、抗凝、利尿、维持水电解质平衡及抗感染等对症干预，对于血清清蛋白低于20 g/L者加用低分子肝素。对照组采用环磷酰胺(山西普德药业股份有限公司，国药准字H20093032)治疗，10 mg·kg-1·d-1，用0.9%生理盐水100 mL稀释后静脉滴注，2次/周，累计剂量小于150 mg/kg。治疗组采取他克莫司(stellas Ireland Co.,Ltd，国药准字J20090142A)治疗，初始剂量为0.05～0.10 mg·kg-1·d-1，血药浓度维持在5～10 ng/mL；保真汤加减治疗，中药组成：附子9 g，干姜15 g，黄芪15 g，白术12 g，甘草9 g，茯苓12 g，当归10 g，生地12 g，党参15 g，芡实10 g，山药12 g，白芍9 g，石苇9 g，黄柏10 g，莲子肉12 g，薏苡仁10 g，大蓟10 g，泽泻12 g；每天1剂，水煎服，每天2次。疗程：两组连续治疗3个月。

1.6观察指标 (1)应用生化分析仪于治疗前后测定血浆清蛋白、24 h尿蛋白定量、三酰甘油及总胆固醇水平；(2)症状评分。依据《中药新药临床研究指导原则》[8]拟定。对面色白光白、浮肿、形寒肢冷、腹水、胸水及大便溏薄按症状分级评分：正常(0分)、轻度(1分)、中度(2分)及重度(4分)，于治疗前后评定；(3)不良反应。观察疗程中两组不良反应发生情况，比较发生率；(4)两组TLR 7mRNA检测。采取实时荧光定量PCR法测定外周血TLR7 mRNA，抽取静脉血4 mL，置于肝素抗凝管，应用TRIzol试剂提取总RNA，严格按试剂说明书反转录合成cDNA，-80 ℃保存备用；TLR7引物：上游5′-TCT TCA ACC AGA CCT CTA CAT TCC-3′，下游5 ′-GGA ACA TCC AGA GTG ACA TCA CA-3′，扩增片段长度为110 bp；β-actin：上游5′-CCG CCA TGT AGG TCG CTA T-3′，下游5′-TGA CAC GCC ATC ACC AG-3′；PCR采取25 μL 反应体系，其中上下游各1.00 μL、Taq 酶0.35 μL、荧光染料0.55 μL、cDNA 1.50 μL、dNTPs 1.50 μL；扩增条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40个循环；TLR 7mRNA值为目的基因与内参照基因的比值；(5)两组血清中核因子(NF)-κB、肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-6水平。采取酶联免疫吸附试验(ELISA)于治疗前后测定。

1.7疗效标准 依据《中药新药临床研究指导原则(试行)》[8]评定。痊愈：血清蛋白大于或等于35 g/L，尿蛋白定量持续小于或等于0.2 g/24 h，症状评分降低大于或等于90%，三酰甘油和血总胆固醇基本正常。显效：血清蛋白在30～35 g/L，尿蛋白定量小于1 g/24 h，症状评分下降大于或等于60%。改善：血清蛋白有所好转，尿蛋白定量小于3 g/24 h，症状积分下降大于或等于30%。无效：尿蛋白、血清蛋白未见显著好转，症状积分下降小于30%。总有效率=(临床痊愈+显效+改善)例数/总例数×100%。

2 结 果

2.1两组血浆清蛋白、24 h尿蛋白定量、三酰甘油和总胆固醇水平比较 两组治疗后血浆清蛋白水平显著提高，24 h尿蛋白定量、三酰甘油、总胆固醇水平明显下降(P<0.01)。治疗组治疗后血浆清蛋白水平明显高于对照组，24 h尿蛋白定量、三酰甘油、总胆固醇水平明显少于对照组(P<0.01)，见表1。

表1 两组血浆清蛋白、24 h尿蛋白定量、三酰甘油总胆固醇水平比较

*：P<0.01，与本组治疗前比较；#：P<0.01，与对照组治疗后比较

表2 两组症状评分比较分)

*：P<0.01，与本组治疗前比较；#：P<0.01，与对照组治疗后比较

2.2两组症状评分比较 两组治疗后面色白光白等症状评分均明显减少(P<0.01)。治疗组治疗后面色白光白等症状评分明显少于对照组(P<0.01)，见表2。

2.3两组疗效比较 治疗组总有效率为94.00%明显优于对照组的77.55%(P<0.05)，见表3。

表3 两组疗效比较

*：P<0.01与治疗组比较

2.4两组不良反应发生比较 治疗组不良反应发生率16.00%，明显低于对照组的40.82%(P<0.05)，见表4。

表4 两组不良反应发生比较

*：P<0.05，与治疗组比较

2.5两组TLR7 mRNA和血清NF-κB、TNF-α、IL-6水平比较 治疗后两组TLR7 mRNA和血清NF-κB、TNF-α、IL-6水平显著降低(P<0.01)。治疗组治疗后TLR7 mRNA和血清NF-κB、TNF-α、IL-6水平显著少于对照组(P<0.01),见表5。

表5 两组TLR 7mRNA和血清NF-κB、TNF-α、IL-6水平比较

*：P<0.01，与本组治疗前比较；#：P<0.01，与对照组治疗后比较

3 讨 论

环磷酰胺是RNS的一线经典药物治疗方案，被广泛应用于临床治疗和随机对照试验研究。而他克莫司可替代环磷酰胺，且用于RNS患儿有效性高于环磷酰胺[2]。文献[9]报道他克莫司对RNS的短期疗效好，但随着时间延长他克莫司会出现药物疗效下降和伴严重不良反应，患儿的耐受性明显降低。因此，针对RNS的治疗，如何解决上述问题，本研究将中药复方联合他克莫司与环磷酰胺对比，可以获得较代表性的数据。

RNS属中医学“虚损”“尿浊”等范畴。关于RNS的病机虽众说纷纭，然而脉证相参，分析其病理，脾肾两虚、湿浊潴留是该病基本病理。盖脾主运化，作用于精微的摄取与水液的输布；肾司开阖，作用于精气的藏蓄与湿浊的排泄。《病机沙篆》记载：“夫人之虚…而独举脾肾者，水为天一之元，土为万物之母，二脏安和，诸经各治”。《素问·至真要大论》曰：“诸湿肿满，皆属于脾”。《水热穴论》亦云：“肾者，胃之关也，关门不利，故聚也而从其类也”。太阴虚则运化无权，难以摄取精微，又难以输布水液；少阴虚则开阖失常，未能固摄精气，又未能排泄湿浊。清不升而浊不降，渐致血清清蛋白偏低、胆固醇反高，尿蛋白大量丧失。因知RNS的浮肿乏力等症，确与脾肾同病、湿浊中困有关。然“无阴则阳无以化，无阳则阴无以生”，且湿浊易从热化。故治法宜以脾肾虚损为要，气阴兼顾，湿热两清。

保真汤出自《证治准绳》，基于RNS病理的正确认识和前期研究而提出来的，并根据脾肾阳虚证进行了加减应用。方中附子温肾助阳兼暖脾土，附子善温肾阳而助气化以行水，干姜偏于温脾阳助运化以制水；党参、黄芪、白术、茯苓补气健脾，茯苓利水渗湿使水邪从小便去，白术健脾燥湿以促进脾阳健运；白芍防附子燥热伤阴，利于久服缓治；当归、生地滋阴补血；莲子肉、芡实、山药平补脾肾；薏苡仁、石苇、大蓟、黄柏、泽泻清化湿热；甘草益气健脾、协调全方；该方脾肾双补，补气益阴，利湿退热，切中本病病理。

本研究结果显示，作为中药复方保真汤联合他克莫司治疗RNS脾肾阳虚证，在改善临床症状体征(面色白光白、浮肿、形寒肢冷、腹水、胸水及大便溏薄)、提高血浆清蛋白和降低24 h尿蛋白定量、三酰甘油、总胆固醇水平方面均优于对照组的强的松联合环磷酰胺方案；治疗3个月后，对照组的总有效率为94.00%，也明显高于对照组的77.55%；同时，治疗组不良反应更小，患儿依从性良好。因此，中药复方保真汤加减联合经典西药是治疗RNS的有效方案。

湿浊潴留是肾病综合征的基本病理，水湿也可进一步伤阳、化热，使湿热形成，推动疾病发展的主要病理环节，水湿郁久必生湿热，或肾病日久，阳损及阴，使真阴亏虚，虚热内生，热与湿互结而成湿热，湿热不仅是肾病综合征的重要病因，也是引起肾病综合征复发、加重及难治的主因[10]。研究发现，湿热因素干预可上调TLR-7介导信号因子，尤其是下游信号因子NF-κB，通过激发Toll-7-NF-κB信号通路加重湿热致病程度[11]。文献[12-13]报道称TLR7通过髓样分化因子/NF-κB通路进行信号转导，提高促炎细胞因子如TNF-α和IL-6表达，启动适应性免疫应答，参与许多肾脏疾病的形成，免疫组织化学法也显示TLR7在肾病综合征患儿的肾组织中表达明显增多，且其表达程度与肾病综合征的病理类型相关。其他研究发现，TLR7-NF-κB通路激活可上调TNF-α和IL-6的表达，这些炎性因子可促进肾组织的炎症和损伤，加重RNS病理过程[14-16]。本研究结果发现，治疗组治疗后TLR 7mRNA和血清NF-κB、TNF-α、IL-6水平显著少于对照组(P<0.01)。说明他克莫司联合保真汤加减可能通过抑制TLR7-NF-κB通路，下调 TNF-α和IL-6水平，达到治疗效果。

他克莫司联合保真汤加减治疗RNS脾肾阳虚证有效、安全，治疗方案可通过改变上述通路及其细胞因子水平而发挥作用。本研究不足之处在于：试验设计缺乏阳性药物对照组，没有运用分子生物学等方法探究上述通路在RNS中的作用及本治疗方案的效果，此外本研究纳入的病例量相对较小，对结果可能产生一定偏倚。因此，随机、对照、双盲、多中心的临床试验来评价他克莫司联合保真汤加减的疗效和安全性十分必要。

[1]赵学兰,李香玲,郭民,等.益气活血补肾方对难治性肾病综合征患儿临床疗效及T淋巴细胞亚群、细胞因子的影响[J].中成药,2013,35(8):1637-1640.

[2]陈艳霞，冯益宇，房向东，等．他克莫司与环磷酰胺治疗难治性肾病综合征有效性和安全性的 Meta 分析[J]．中国全科医学，2014，17(17)：2008-2010,2014．

[3]朱琳，米齐悦，占永立，等．难治性肾病综合征中医药治疗进展[J]．中国中西医结合肾病杂志，2016，17(7)：640-641．

[4]李成杰,魏连波,鲁路,等.肾康丸联合西医治疗难治性肾病综合征气虚血瘀夹湿证的临床研究[J].中国实验方剂学杂志,2016,22(6):185-189.

[5]贺茂华．保真汤为主治疗肾病综合征的疗效观察[J]．湖北中医杂志，2001，23(2)：10．

[6]BELLO A K,HEMMELGARN B,LLOYD A,et al.Associations among estimated glomerular filtration rate,proteinuria,and adverse cardiovascular outcomes[J].Clin J Am Soc Nephrol,2011,6(6):1418-1426.

[7]中华中医药学会.中医内科常见病诊疗指南西医疾病部分[S].北京:中国中医药出版社,2008:190-191.

[8]中华人民共和国卫生部．中药新药临床研究指导原则(试行) [M]．北京：中国医药科技出版社，2002：156-167．

[9]叶琨，王浩宇，徐珏，等．他克莫司联合糖皮质激素治疗难治性肾病综合征的临床评估[J]．实用医学杂志，2013，29(9)：1500-1502．

[10]石蒙，张倩，边东，等．从湿热论治难治性肾病综合征[J]．中国中西医结合肾病杂志，2014，15(10)：929-931．

[11]赖鹏华，林培政，王晓萍，等．流感病毒性肺炎湿热证小鼠TLR-7介导信号通路的变化[J]．中医杂志，2011，52(17)：1489-1491,1495．

[12]张芳敏，韩子明，赵德安．Toll样受体4和Toll样受体7在儿童原发性肾病综合征患儿肾组织中的表达及意义[J]．临床儿科杂志，2014，32(6)：512-516．

[13]UDWAN K,BRIDEAU G,FILA M,et al.Oxidative stress and nuclear factor κB (NF-κB) increase peritoneal filtration and contribute to ascites formation in nephrotic syndrome[J].J Biol Chem,2016,291(21):11105-11113.

[15]HAM J R,LEE H I,CHOI R Y,et al.Anti-steatotic and anti-inflammatory roles of syringic acid in high-fat diet-induced obese mice[J].Food Funct,2016,7(2):689-697.

[16]JAFAR T,AGRAWAL S,MAHDI A A,et al.Cytokine gene polymorphism in idiopathic nephrotic syndrome children[J].Indian J Clin Biochem,2011,26(3):296-302.