液相色谱-四级杆串联质谱法测定凉皮汤料中罂粟碱含量

刘新才，宗万里，鲁 刚

(威海市食品药品检验检测中心，山东 威海264209)

罂粟碱([1-(3，4-二甲氧基苯基)甲基]-6，7-二甲氧基异喹啉)是自然界中存在的一种重要的苄基异喹啉类生物碱，在阿片类植物，如罂粟的壳和籽中含量较高.罂粟壳是罂粟科植物的干燥成熟果壳，主要生物活性成分为吗啡、可待因、蒂巴因、罂粟碱和那可汀等，具有敛肺、涩肠和止痛等功能，被用于治疗久咳、久泻、脱肛和脘腹疼痛等疾病，但久服易成瘾.由于罂粟壳的易成瘾性，国内有些不法商贩将其作为食品添加剂加入到食品中，例如火锅底料、方便面调料、凉皮汤料等，以吸引顾客.因此国家有必要通过检测罂粟壳中含有的罂粟碱成分以实现对罂粟壳使用情况的监督.检测食品中罂粟碱含量的方法主要有气相色谱法[1，2]、气质联用法[3]、液相色谱法[4-7]、ELISA法[8，9]、液质联用法[10].本文建立了使用液相色谱-串联质谱法对凉皮汤料中罂粟碱含量的检测方法，该方法测量准确，样品前处理简单，适用于在时限要求较高的情况下，实验室大批量的样品检测.

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

Ultimate 3000型高效液相色谱仪；Thermo fisher TSQ QUANTUM ULTRA三重四极杆质谱检测器(配电喷雾离子源ESI)； HILIC液相色谱柱(2.1 mm ×150 mm，3.5 μm，XBridge)，沃特世公司；0.22 μm有机相针管滤头，Agela 公司；漩涡振荡器(MS3 Digital)，IKA公司；高速冷冻离心机(Neofuge 23R)，上海力申科学仪器有限公司；纯水机(Milli-Q Direct8)，密理博公司；电子天平(JY10002)，上海舜宇恒平科学仪器有限公司.

乙腈：色谱纯，默克公司；甲酸：≥98%，Sigma-Aldrich公司；甲酸铵:≥99%，for HPLC，Shanghai Macklin Biochemical Co.，Ltd；罂粟碱标准物质:10 μg/mL，天津阿尔塔有限公司；实验用水为超纯水.

含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸铵水溶液的制备方法：称取0.63 g甲酸铵溶于1 L水中，加入1 mL甲酸，经0.22 μm水相滤膜过滤.

1.2 仪器条件

1.2.1 液相色谱条件

HILIC液相色谱柱：2.1 mm×150 mm(i，d)，3.5 μm；柱温：35 ℃；流动相梯度洗脱条件见表1所示.

表1 流动相梯度洗脱条件

1.2.2 质谱参考条件

(1)电离方式：电喷雾电离，正离子扫描模式；

(2)喷雾电压：3.5 kV(正模式)；

(3)蒸发器温度：常温；

(4)鞘气(N2)压力：35 arb；

(5)辅助气(N2)流量：10 arb；

(6)碰撞室(氩气)压力：1.5 mTorr；

(7)离子传输毛细管温度：350 ℃；

(8)扫描方式：选择反应监测(SRM)；

(9)质谱divert valve状态：0～3 min时处于InjectWaste状态，3～6 min时处于LoadDetector状态，6～15 min时处于InjectWaste状态；

(10)碰撞能量如表2所示.

表2 罂粟碱的离子碎片及碰撞能量

1.3 标准溶液的制备

准确吸取0.5 mL罂粟碱标准溶液至50 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到浓度为1 μg/mL的罂粟碱标准溶液.

首先从1 μg/mL的罂粟碱标准溶液中，分别吸取20.0，40.0，80.0，100.0，200.0 μL，加入到5个含有1.0 g罂粟碱空白样品的50 mL刻度离心管中，然后往每个刻度离心管中分别加入乙腈至10 mL，涡旋混合器提取1 min，经高速离心机以8 000 rpm/min离心5 min，得到浓度分别为2，4，8，10.0，20.0 ng/mL的含有罂粟碱的标准溶液.分别取10 μL每个质量浓度不同的标准溶液注入液相色谱-串联质谱联用仪进行分析，利用外标法绘制标准曲线.

1.4 样品前处理

称取1.00 g(精确至0.01 g)凉皮汤料样品于50 mL刻度离心管中，加入乙腈至10 mL，涡旋混合器提取2 min，经高速离心机以8 000 rpm/min离心5 min，取清液用0.22 μm的针头滤膜过滤后注入液相色谱-串联质谱联用仪进行分析.

2 结果与讨论

2.1 样品前处理

罂粟碱能够溶解在乙腈中，乙腈对样品中的蛋白具有一定的沉淀作用，而且油脂不溶于乙腈.使用乙腈对样品中的罂粟碱进行提取，经过高速离心机离心后，得到澄清的上层溶液，上层溶液能够较为容易地通过0.22 μm的有机滤膜.样品处理液中乙腈与水的比例接近9：1，与流动相中有机相与水相的初始比例一致.

2.2 色谱及质谱条件

本文采用HILIC色谱柱(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)，在梯度洗脱的条件下对罂粟碱进行分离洗脱，罂粟碱在HILIC柱上有较好的保留，且保留时间在4.4 min左右.在质谱条件方面，利用质谱检测器自身所具有的方法优化功能，首先选出罂粟碱的三个丰度最强的子离子，然后选取其中丰度最强的子离子设为定量离子，其余两个设为定性参考离子，最后利用仪器所带软件优化出每个离子对的最佳碰撞能量，最佳碰撞能量如表2所示.

2.3 色谱图

在1.2的色谱及质谱条件下，分别得到罂粟碱标准品在SRM方式下的总离子流图、空白样品的总离子流图和加标空白样品的总离子流图，如图1、2、3所示.加标样品谱图无干扰，在该色谱条件下，色谱结果良好.

图1 标准样品在SRM方式下的总离子流图

图2 未知样品SRM方式下的TIC色谱图

2.4 标准曲线和最低检出限

在以上实验条件下，以标准物峰面积y为纵坐标，质量浓度x(μg/mL)为横坐标绘制标准曲线，得到线性方程，再以基线噪声10倍峰面积对应的质量浓度为定量限(S/N=10)[11]，回归方程、相关系数及检出限如表3所示.

图3 加标未知样品SRM方式下的TIC色谱图

目标物测定浓度范围/(ng/mL)线性回归方程相关系数定量限/(μg/kg)罂粟碱2～20y=157476x+1144040.99751.25

2.5 精密度和加标回收实验

取不含罂粟碱的凉皮汤料空白样品进行加标回收实验，分别向1 g不同样品中添加1 μg/mL罂粟碱标准溶液20，100，200 μL，即样品中罂粟碱含量为分别为20，100，200 μg/kg.按上述1.3.2样品处理方法进行样品处理，每个浓度水平做6次平行处理.按1.2色谱及质谱条件进行测定，精密度、回收率计算结果如表4所示.可以看出，采用本方法所得数据能够满足检测要求.

表4 样品添加回收和精密度实验 (n=6)

2.6 未知样品测定

利用液相色谱-吊联质谱检测方法对市售的8份购自不同商贩的凉皮汤料中罂粟碱含量进行检测，均未检出罂粟碱.

3 结论

通过实验建立了凉皮汤料中罂粟碱含量的液相色谱-串联质谱检测方法.样品经过乙腈处理，离心后取上清液注入液相色谱-串联质谱仪进行检测，通过样品空白基质加标绘制标准曲线的方法对回收率以及在电喷雾离子源上可能产生的样品基质效应进行校正，利用质谱仪自带的divert valve分流阀分流流动相以降低对离子源以及质谱检测器的污染.该方法精密度及加标回收率均满足要求，前处理简单、结果稳定，适合实验室大批量样品的快速检测.

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