1株鸡传染性法氏囊病毒VP2基因的克隆及其分子流行病学分析

冯金芳，何海汛，孙国鹏* ，王选年*

(1.河南科技学院 动物科学学院，河南 新乡453003;2.新乡学院生命科学学院/生物技术研究中心，河南 新乡453003)

鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是一种以法氏囊组织为感染靶器官的急性高度传染性疾病，该病易在2～14周龄鸡中发生，特别是对法氏囊组织尚未退化的雏鸡危害极为严重，严重破坏感染鸡的中枢免疫器官法氏囊组织［1］。目前，尽管有相应的疫苗对其进行防控，但由于病毒变异、环境因素等多种因素影响，导致近年来该病出现了一些新的病理特征和分子流行病学特征，给养殖业带来日益严重的危害。

传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)是副黄黏病毒的一种，属于双链RNA病毒。病毒颗粒呈二十面立体对称的空间三维结构［2-5］，组成该类病毒基因组的RNA共分为2个片段，分别编码不同的功能区域，按基因组功能可以分为编码区和非编码区［6-9］。编码区由A、B 2个基因片段组成，A片段编码区编码前体多聚蛋白NH2－pVP2－VP4－VP3－COOH(分子质量约为 110 ku)，翻译加工形成512个氨基酸组成的多聚VP2外壳蛋白、242个氨基酸的VP4蛋白和256个氨基酸的VP3蛋白。非编码区域主要存在于RNA片段的两端，在编码A片段基因的两端分别有96 bp和134 bp大小的非编码序列，编码B片段的基因两端分别有79 bp和111 bp大小的非编码序列，且这些非编码片段相互之间存在碱基互补的特点。这种互补序列可以形成发夹式构象，能使RNA稳定存在，与RNA复制、转录和翻译过程有关［5］。

前人研究认为，组成IBDV的结构蛋白主要有5种，分别为分子质量约90 ku的 VP1、约40 ku的VP2、约35 ku的 VP3、约 29 ku的 VP4和 17 ku的VP5。VP2蛋白是血清特异性抗原，单独VP2蛋白即可诱导鸡成纤维细胞发生凋亡，是决定IBDV毒力的主要因子［6］。VP2蛋白在致病性上起着决定性的作用，也是引起宿主细胞凋亡的主要因子之一。在VP2蛋白的第206—350位氨基酸区域称为VP2高变区，整个亲水区的变异决定着病毒毒力的大小、抗原性的改变，甚至是新型变异株的出现［7］。而且，VP2蛋白在可变区内含有与毒力相关的抗原表位，属于中和性表位，有毒力特异性，能区分IBDV强毒株和弱毒株［8-11］。因此，VP2蛋白的高变区是基因工程疫苗的重点研究对象。本研究拟通过对1株分离于新乡地区某鸡场的IBDV毒力相关基因VP2进行克隆，与GenBank中公布的IBDV主要流行毒株VP2高变区，特别是与毒力相关的2个亲水区和1个七肽区进行比对分析，研究IBDV分离毒株的分子流行病学特征，旨在为IBD的防控奠定基础。

1 材料和方法

1.1 供试动物病料来源与处理

采集新乡地区某鸡场疑似IBDV感染病鸡的法氏囊组织，低温保存。取1 g采集到的法氏囊组织并剪碎，研磨成匀浆，再加入5倍体积PBS缓冲液混匀，冻融3次，1 000×g离心10 min，收集上清液。

1.2 主要仪器和试剂

微量蛋白核酸分析仪为Nano Vue公司产品;低温高速离心机为Thermo Fisher公司产品;PCR仪由BIOMETRA生产;凝胶成像系统为美国BIO－RAD公司产品;Trizol LS试剂为 Invitrogen公司产品;rTaq聚合酶为 TaKaRa公司产品;DL2000 DNA Marker为TaKaRa公司产品;IBDV快速检测试纸条由河南科技学院动物科学学院实验室制备。

1.3 法氏囊组织总RNA的提取和VP2高变区的PCR扩增

参照上海生工生物技术公司RNA提取试剂盒操作说明进行法氏囊组织RNA的提取，并反转录为cDNA。然后根据鸡法氏囊病毒VP2核苷酸序列，采用DNAStar软件设计引物，用于扩增VP2高变区，理论设计扩增长度为593 bp，引物序列为VP2－1:5'－TGATCTTGGGTATGTGAGG－3';VP2－2:5'－GCTAGTTCAGGATTTGGGAT－3'，将序列发送到上海生工生物技术公司合成。

以法氏囊组织cDNA为模板，对IBDV VP2高变区进行 PCR 扩增，反应体系:2.5 μL 10×Buffer，2.0 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.5 μL rTaq，1.0 μL 10 μmol/L上、下游引物，1.0 μL cDNA，补加 ddH2O 至总体积25.0 μL。混匀后瞬时离心，置PCR仪中进行反应:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环;72℃ 10 min。PCR反应完成后取5 μL样品电泳检测(0.5 μg/μL EB 染色)。同时取适量 PCR产物寄至上海生工生物技术公司进行测序，将测序结果与国内部分经典毒株进行基因同源性分析。

1.4 IBDV分离毒株VP2高变区的分子流行病学分析

用MEGA 6.0软件将VP2基因序列翻译成氨基酸序列，将翻译后的氨基酸序列与河南地区的主要IBDV流行毒株及经典毒株进行VP2高变区对比分析，绘制进化树。

IBDV主要流行毒株具体信息见表1。

表1 IBDV参考毒株信息

2 结果与分析

2.1 IBDV分离毒株VP2高变区的PCR扩增结果

从图1可以看出，在593 bp处有特异性条带出现，与预期扩增大小一致。表明分离毒株为IBDV，且成功克隆其VP2高变区。

图1 IBDV VP2高变区扩增结果

2.2 IBDV分离毒株VP2高变区的分子流行病学分析

2.2.1 VP2高变区氨基酸序列推导及同源性分析测序结果进一步表明，分离毒株为IBDV，将其命名为XX511。采用MEGA 6.0软件将测序的基因序列翻译为氨基酸序列(图2)。同源性分析结果显示，XX511毒株与超强毒株D49706、AJ878898的同源性均为 96.8%，与超强毒株 AF499929、弱毒株X16107 的同源性分别为 95.8%、96.3%，与广东地区JQ911703毒株具有100%的同源性。

图2 IBDV XX511毒株VP2高变区DNA序列及其推导氨基酸序列

2.2.2 VP2高变区氨基酸序列比对结果 为明确XX511毒株VP2高变区的氨基酸变异情况，分析XX511毒株基因序列、部分IBDV经典毒株和河南地区部分流行毒株基因序列，比较其氨基酸不同位点。从XX511毒株与经典毒株及河南地区流行毒株VP2高变区序列比对结果可以看出，XX511毒株在217位变异明显，由S变异为L(表2、表3)。将XX511毒株与经典毒株七肽区序列进行比较发现，仅第5位氨基酸与X16017、AF499929毒株不一致(表4)。由以上结果可以得出，分离毒株XX511的抗原性基本未发生变化，具备正常的致病力，但是217位氨基酸的变化可能会改变XX511毒株的毒力。

表2 XX511毒株与经典毒株VP2高变区序列比较

表3 XX511毒株与河南地区流行毒株VP2高变区序列比较

表4 XX511毒株与经典毒株七肽区序列比较

2.2.3 VP2亲水区序列比对结果 氨基酸212D—224G是第一亲水区，该区域对VP2蛋白的稳定性具有重要作用;氨基酸314T—324Q是第二亲水区，属于诱导产生中和性抗体的抗原表位。由表5、表6可知，第一亲水区仅217位点变异明显，第二亲水区氨基酸位点均未发生变化。可见，XX511毒株的抗原决定簇和稳定性与经典毒株不同，发生变异是导致毒力加强的主要原因，而中和抗原表位与经典毒株相同，未发生变异。

表5 XX511毒株与经典毒株的第一亲水区氨基酸比较

表6 XX511毒株与经典毒株的第二亲水区氨基酸比较

2.2.4 XX511毒株与国内外毒株进化树分析 为了确定XX511与其他毒株的进化关系，利用MEGA 6.0软件计算并分析XX511毒株VP2高变区氨基酸序列与国内其他毒株VP2高变区氨基酸序列，得到不同IBDV毒株的进化关系(图3)。从图3可见，与XX511毒株在同一分支的超强毒株有JQ911703。

图3 基于XX511毒株VP2高变区氨基酸序列的进化树分析

3 结论与讨论

本试验中，为保证采集到的法氏囊组织为IBDV感染致病组织，采用IBDV病毒快速检测试纸条对采集到的病料进行检测。结果表明，采集法氏囊组织研磨液样品出现了明显的阳性条带，说明采集的法氏囊组织为IBDV感染致病组织。

利用RT－PCR技术从分离的毒株中成功克隆XX511毒株VP2高变区基因。分离到的毒株与超强毒株均有较高的同源性，XX511毒株与超强毒株D49706、AJ878898 的同源性均为96.8%。

超强毒株VP2高变区基因序列主要特征有:VP2高变区中的丙氨酸(222)、谷氨酰胺(249)、甘氨酸(254)、天冬氨酸(279)、丙氨酸(284)、异亮氨酸(294)、丝氨酸(299)及七肽区的丝氨酸、色氨酸、丝氨酸、丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丝氨酸高度保守［12-14］，这些因素保证了超强毒株的抗原性、致病力和毒力。同时有研究表明，高变区与2个亲水区之间还存在3个小的亲水部位，分别位于248—252位氨基酸、279—290位氨基酸、299—305位氨基酸，它们的变异会使抗原性或毒力发生变化［15-16］。从XX511毒株和经典毒株VP2高变区序列比对结果可以看出，XX511毒株在217位变异明显，由S变异为L。XX511毒株与河南地区流行毒株VP2高变区序列比较结果得出，XX511毒株在217位氨基酸变异最明显。从XX511毒株和经典毒株七肽区序列比较结果可知，仅第 5位氨基酸与 X16017和AF499929毒株不一致。河南省的流行毒株均为强毒株［17-20］，而XX511毒株则表现出不同的分子流行病学特征，表明IBDV在河南地区的流行特征发生了一些不同的变化。

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