虎杖转录因子PcMYB1基因的克隆及原核表达

柳忠玉，雷 健，李晓筱，刘 婵，覃建兵，许 锋

(1.长江大学生命科学学院，湖北荆州434025;2.长江大学园艺园林学院，湖北荆州434025)

苯丙烷类物质在植物中普遍存在，这类次生代谢产物以羟基芳香环为共同特征，包括总黄酮、黄酮醇、香豆素、木质素、花青素、单宁以及白藜芦醇等。近年来，通过对拟南芥、玉米、金鱼草和矮牵牛等植物的研究，发现了一系列髓细胞组织增生病毒癌基因同源物(MYB)转录因子作为调节蛋白广泛参与植物苯丙烷类次生代谢的调控［1］。MYB也参与调控药用植物药效成分合成，丹参SmMYB39通过调控苯丙烷类代谢途径关键酶基因的表达，进而影响迷迭香酸的合成［2］。水母雪莲中bHLH和WD40两种转录因子形成二元复合体后，和MYB转录因子共同调控类黄酮合成途径中结构基因的表达［3］。苦荞种子萌发过程中子叶中黄酮的积累受FtMyb2与FtMyb3的调控［4］。在紫外线、伤害和病原菌等胁迫条件下，葡萄VvMYB14和VvMYB15调控白藜芦醇合酶基因的表达，进而影响白藜芦醇的合成［5-6］。

虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.)是蓼科多年生草本植物，根或根茎入药，富含白藜芦醇、类黄酮等药效成分。其中白藜芦醇具有显著抗肿瘤、抗衰老、保护心血管系统等生物学功能［7］。虎杖富含的白藜芦醇、类黄酮等都经由苯丙烷类代谢途径而来。目前，对虎杖苯丙烷类代谢的研究多集中在结构基因上，例如查尔酮合酶基因PcCHS［8］、聚酮合成酶基因PcPKS［9-10］等。前期已经对虎杖苯丙烷代谢途径中的结构基因白藜芦醇合酶基因PcRS进行了功能鉴定［11-12］。而有关MYB转录因子对虎杖苯丙烷类代谢的调控作用知之甚少。鉴于此，从虎杖叶片中克隆苯丙烷类代谢相关的MYB转录因子基因，对其进行生物信息学分析，构建MYB基因的原核表达载体并诱导表达，为研究MYB对虎杖苯丙烷类代谢的调控奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

虎杖植株由广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心提供。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、pMD18－T载体购自TaRaKa公司。总RNA提取试剂盒、cDNA第1链合成试剂盒和凝胶回收试剂盒购自Tiangen公司。SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit购自Clontech公司。

1.2 方法

1.2.1 虎杖叶片总RNA的提取及反转录 以野生虎杖叶片为材料，用Trizol法提取总RNA，用cDNA第1链合成试剂盒将总RNA反转录成cDNA备用，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.2 MYB基因保守区域片段的获得 对已经公布的苯丙烷类代谢相关的R2R3－MYB转录因子的核酸序列和氨基酸序列进行分析，在保守区域设计简并引物MYBf和MYBr(表1)。以虎杖叶片cDNA为模板进行RT－PCR，PCR反应条件为:94℃预变性2 min;94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环;72℃延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。将PCR产物进行回收并连接至pMD18－T载体上，转化大肠杆菌DH5α进行克隆，挑取单菌落进行菌液PCR检测，将阳性菌落送至上海生工生物公司进行测序。

表1 PcMYB1基因引物序列

1.2.3 cDNA末端扩增 3'RACE 和 5'RACE第1链的合成按照Clontech公司试剂盒使用说明进行。根据测序结果设计3'RACE和5'RACE引物(引物序列见表1)，进行PCR扩增。回收扩增产物并连接至pMD18－T载体，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆并测序。

1.2.4 PcMYB1全长cDNA拼接及生物信息学分析将获得的MYB保守区域片段和两端序列进行拼接，获得PcMYB1基因的cDNA全长序列。将PcMYB1序列在NCBI数据库中用BLAST工具进行同源分析;利用ORF(Open reading frame)finder软件寻找开放阅读框;利用Protparam软件分析编码蛋白的氨基酸序列组成、分子质量、等电点等理化性质;采用SWISS－MODELSOPMA进行蛋白质二级结构分析。利用软件DNAMAN进行多重序列比对;利用软件ClustalX 2.1和MEGA 5构建系统进化树。用作同源性和进化树分析的序列均来源于GenBank，具体情况列于表2。

1.2.5 PcMYB1基因原核表达载体的构建 根据原核表达载体pET28a和PcMYB1基因cDNA序列信息，设计1对特异引物ORFf和ORFr扩增该基因ORF。PCR扩增条件为:94℃预变性2 min;94℃变性 30 s、59℃退火 30 s、72℃延伸1 min，30个循环;72℃延伸10 min。反应结束后，将PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收。用BamHⅠ和HindⅢ分别酶切 PCR回收产物和原核表达载体pET28a，用T4 DNA连接酶连接回收纯化的目的片段和切开的载体，并转化大肠杆菌DH5α，经BamHⅠ和HindⅢ双酶切以及测序鉴定后获得的阳性克隆即为重组原核表达载体，并命名为 pET28a－Pc-MYB1。

表2 多重序列比较和进化分析所用MYB蛋白

1.2.6 重组菌 pET28a－PcMYB1/BL21(DE3)诱导表达 将测序正确的重组质粒pET28a－PcMYB1转化至表达菌株E.coli BL21(DE3)，得到重组菌pET28a－PcMYB1/BL21(DE3)。挑取单菌落接种于含卡那霉素(50 μg/mL)的LB培养基内，37℃振荡过夜培养。次日以1%量接种于含有相应抗生素的LB培养基，37℃培养至OD600约为 0.5时，吸出1 mL菌液作对照，其余加入IPTG(终浓度为 0.5 mmol/L)，诱导3 h后，收集1 mL菌液，将收集的菌液于4℃、12 000 r/min离心5 min，弃上清，向沉淀中加入200 μL PBS缓冲液，充分混匀后加入50 μL 5×SDS上样缓冲液，100℃煮沸10 min，4℃冷却。取15 μL样品上样，12%SDS－PAGE电泳检测。电泳结束后，考马斯亮蓝染色，最后成像分析。

2 结果与分析

2.1 虎杖PcMYB1基因cDNA全长的获得及序列分析

提取虎杖叶片总RNA用于RT－PCR，利用简并引物MYBf和MYBr，以cDNA为模板扩增MYB基因保守区域，挑选阳性克隆测序得到1个长336 bp的保守区域片段(图1－A)。设计特异引物3'GSP1和3'GSP2，参照试剂盒说明进行3'RACE，扩增得到1个长1 056 bp的带有多聚A尾巴的片段(图1－B)。设计特异引物5'GSP1和5'GSP2，参照试剂盒说明进行5'RACE，扩增得到1个长398 bp的片段(图1－C)。将获得的两端序列与保守区域片段序列进行拼接得到1段长1 152 bp的cDNA序列，命名该基因为 PcMYB1(GenBank登录号为KY495789)。

图1 PcMYB1基因的PCR扩增结果

序列分析表明，PcMYB1基因的5'端有长度为190 bp的非编码区，3'端有长度为149 bp的非编码区，开放阅读框ORF由813个核苷酸组成，编码1个含有270个氨基酸的蛋白质，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA(图2)。利用ExPASy软件的Protparam预测PcMYB1编码蛋白的理化性质，推测该蛋白质分子式为C1325H2095N395O403S14，总原子数为4 232，分子质量为 30.455 ku，理论等电点(pI)为8.6。采用 SWISS－MODELSOPMA 进行PcMYB1编码蛋白的二级结构分析，PcMYB1编码蛋白的二级结构中α－螺旋占24.07%、延伸链占13.70%、β 转角占 6.67%、无规则卷曲占 55.56%。

2.2 虎杖PcMYB1蛋白的同源性分析及进化树构建

为研究PcMYB1蛋白与其他MYB蛋白的进化关系，选取拟南芥次生代谢调控相关的MYB亚家族(Sg3、Sg4、Sg5、Sg6、Sg7)蛋白以及来源于其他植物的典型Sg4亚家族成员，构建进化树。结果显示，PcMYB1和葡萄的VvMYB4a、桉树的EgMYB1、矮牵牛的 PhMYB4、玉米的 ZmMYB31、柳枝稷的PvMYB4a、拟南芥的AtMYB4和AtMYB32等转录因子聚类到Sg4亚家族(图3)，说明PcMYB1蛋白是Sg4亚家族MYB蛋白。利用BLAST进行同源性分析，结果表明，虎杖 PcMYB1与矮牵牛 PhMYB4(ADX33331)、葡萄 VvMYB4a(ABL61515)、桉树EgMYB1(CAE09058)、拟南芥 AtMYB4(AAC83582)、玉米 ZmMYB31(NP_001105949)、柳枝稷 PvMYB4a(AEM17348)、拟南芥 AtMYB32(NP_195225)有着较高的同源性，分别为67%、64%、63%、59%、58%、58%、56%。

图2 PcMYB1基因的核苷酸序列和推测的氨基酸序列

图3 PcMYB1与其他物种MYB氨基酸序列的系统进化树分析

利用DNAMAN软件进行多重序列比对发现，虎杖PcMYB1蛋白与其他MYB转录因子的保守区域主要集中在N端，虎杖PcMYB1蛋白在N端具有2个典型的MYB DNA结合域，即R2、R3结构域，为典型的R2R3－MYB转录因子(图4)。结果表明，PcMYB1蛋白符合R2R3－MYB类转录因子的特征。在PcMYB1蛋白的C端区域具有4个典型的Sg4亚家族的保守基序(图4):C1基序LLsrGIDPX［T/S］HRX［I/L］，C2基序pdLNL［D/E］LXI［G/S］，C3 基序CX1－2CX7－12CX1－2C，C4 基序 FLGLX4－7L［D/G］［F/Y］［R/S］XLEMK，其中 C2基序 pdLNL［D/E］LXI［G/S］为典型的抑制结构域。

2.3 原核表达载体pET28a－PcMYB1的构建

将PcMYB1基因的ORF区域(813 bp)构建到载体 pET28a中，获得原核表达载体 pET28a－PcMYB1。对原核表达载体pET28a－PcMYB1进行菌液PCR鉴定，获得1条800 bp左右特异性片段(图5－A)。将原核表达载体pET28a－PcMYB1用BamHⅠ和HindⅢ酶切，切出大小约800 bp的片段，该片段为PcMYB1基因的ORF片段，如图5－B箭头所示。同时测序结果表明，连入表达载体pET28a中的PcMYB1基因片段与目的序列一致，未出现碱基突变和移码现象。将pET28a－PcMYB1质粒转化大肠杆菌感受态BL21(DE3)后，得到重组菌pET28a－PcMYB1/BL21(DE3)。

2.4 重组菌 pET28a－PcMYB1/BL21(DE3)的诱导表达

PcMYB1基因的ORF由270个氨基酸组成，理论蛋白分子质量为30.455 ku，融合His－Tag标签后理论分子质量为31.28 ku。由12%SDS－PAGE电泳结果可知(图6)，与未诱导的重组菌pET28a－Pc-MYB1/BL21(DE3)相比，IPTG诱导的重组菌在31 ku左右处出现特异条带，特异条带的大小与理论值相符。结果表明，重组菌 pET28a－PcMYB1/BL21(DE3)已成功表达目的蛋白PcMYB1(如图6箭头所示)。

图6 pET28a－PcMYB1/BL21(DE3)诱导产物的SDS－PAGE电泳分析

3 结论与讨论

植物MYB转录因子结构域的N端区域都是高度保守的，该结构域由1～3个串联的且不完全重复的R结构(R1、R2、R3)组成，而且绝大多数植物中的MYB类转录因子是含2个MYB结构域的R2R3－MYB蛋白［13-14］。对于基因组大、尚未完成基因组测序的物种，采用同源克隆的方法研究重要功能基因是一种可行的方法。本研究基于同源克隆的策略，从虎杖叶片成功克隆1个R2R3－MYB同源基因，命名为PcMYB1，以便研究PcMYB1基因的功能及其对虎杖苯丙烷代谢的调控作用。

根据C端功能基序的不同，MYB转录因子被分成了 28个亚家族［1，15］。进化树分析发现，虎杖PcMYB1蛋白和 Sg4亚家族的 AtMYB4、AtMYB32、VvMYB4a、EgMYB1、PhMYB4、ZmMYB31、PvMYB4a等聚为一类，说明PcMYB1编码蛋白属于Sg4亚家族。来自Sg4亚家族的AtMYB4是拟南芥中发现的第1个R2R3类负调控因子，该因子通过靶向抑制类黄酮物质芥子酸酯合成关键基因C4H来负调节植物对UV－B的耐受性［16］。AtMYB4蛋白的 C末端有1个抑制结构域 C2 基序 pdLNL［D/E］LXI［G/S］，AtMYB4蛋白可能通过直接与靶基因结合而抑制靶基因的转录，或同时作为其他激活因子的竞争者来抑制靶基因的表达。C2基序 pdLNL［D/E］LXI［G/S］也存在于Sg4亚家族的其他负调控因子(AtMYB32、VvMYB4a、EgMYB1、PhMYB4、ZmMYB31、PvMYB4a等 ) 中。 其 中 AtMYB32［17］、EgMYB1［18-19］、Zm-MYB31［20］、PvMYB4a［21］被鉴定为在木质素生物合成中起转录抑制作用。矮牵牛PhMYB4通过负调控查尔酮合酶基因PhCHS的表达，进而影响类黄酮的合成［22］。葡萄VvMYB4a也被证实在其介导的相关植物生长发育过程中起负调节作用［23］。Xu等［24］在裸子植物银杏中也发现类似于AtMYB4的转录抑制子GbMYBF2，其在拟南芥中的过表达能显著抑制花青素及黄酮类物质的生成。由此可见，众多研究已表明，含有抑制结构域C2基序pdLNL［D/E］LXI［G/S］的MYB转录因子在苯丙烷类(木质素、黄酮、花青素等)合成中起转录抑制作用。本研究得到的虎杖PcMYB1蛋白同样具有抑制结构域C2基序 pdLNL［D/E］LXI［G/S］，因此，推测PcMYB1蛋白是一个负调控因子，但其表达特性与调控模式，还需要进一步转化模式植物加以验证。

MYB转录因子可以与多种顺式作用元件结合，调控下游基因的表达。目前，多采用体外凝胶迁移(EMSA)来鉴定蛋白质与元件的作用情况［25］。本研究已经构建含有PcMYB1基因的重组质粒并且在大肠杆菌中成功表达目标蛋白。后续将纯化该蛋白，用于EMSA鉴定PcMYB1蛋白与元件的作用情况，有利于进一步研究虎杖转录因子PcMYB1蛋白的分子生物学功能。目前，对虎杖苯丙烷类代谢中MYB转录因子的功能知之甚少，本研究的开展为虎杖苯丙烷类代谢的深入理解奠定基础。

本研究从虎杖叶片中成功克隆了1个R2R3－MYB类转录因子PcMYB1基因，PcMYB1基因含有长为813 bp的开放读码框，编码270个氨基酸残基。虎杖PcMYB1属于Sg4亚家族，序列的C端存在1个抑制结构域 C2基序 pdLNL［D/E］LXI［G/S］。虎杖PcMYB1与已知的矮牵牛PhMYB4序列相似性最高。构建了PcMYB1的原核表达载体pET28a－Pc-MYB1，并在大肠杆菌表达菌株BL21中成功表达。

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