花旗泽仁主要活性成分在大鼠尿液和粪便中的代谢研究

于鹏洋，李璐，赵聪，郑义，朱蕾，刘萍，韩东卫,葛鹏玲*

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157000； 3.牡丹江医学院附属红旗医院，黑龙江 牡丹江 157011； 4.中国人民解放军军事经济学院门诊部，湖北 武汉 430000)

中药复方口服后其真正发挥药效作用的物质既可能是原型药物，也可能是代谢产物[1]。方剂组方复杂，成分繁多，干扰因素较多，选取UPLC-Q-TOF-MS技术应用于不同生物样品中微量成分和代谢产物的鉴定，具有分析时间短，检测灵敏度高的优势。联合Metabolynx软件通过比对空白样品与含药样品，分析去除干扰离子来简化质谱图的解析，从而在复杂生物基质中快速检测出药物代谢产物，为阐明其作用机制及临床合理用药提供参考[2-3]。

花旗泽仁是临床上治疗2型糖尿病的经验方，本课题组前期工作已完成其主要药效学研究，为进一步完善花旗泽仁成药的评价，本文选择花旗泽仁主要活性成分人参皂苷Rb1、泽泻醇A-24-醋酸酯及9-HODE作为研究对象，采用UPLC-Q-TOF/MS技术分析完成花旗泽仁3种活性成分及其代谢产物通过尿液和粪便的排泄情况。

1 实验动物

清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠6只，雄性，3月龄，体质量(200±20)g，购于黑龙江中医药大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK(黑)2013-004。实验动物适应性喂养一周，明暗周期12 h，房间温度在(20±2)℃，相对湿度50%左右，通风良好，勤换垫料，自由摄食和饮水。

2 实验方法

2.1 花旗泽仁标准混合液的制备

取花旗泽仁水煎液100 μL，置1.5 mL离心管中，12 000 rpm高速离心10 min，取上清液过0.22 μm微孔滤膜后经HPLC-MS/MS测定。结果表明,花旗泽仁提取物中主要活性成分的百分比如下：人参皂苷0.16%、泽泻醇A-24-醋酸酯0.004 5%、9-HODE 0.013%。花旗泽仁标准混合液按照主要活性成分百分比进行配置。精密称取适量人参皂苷Rb1、泽泻醇A-24-醋酸酯及9-HODE各标准品适量，配置如下浓度的标准混合药液：人参皂苷Rb1为96 mg/mL，泽泻醇A-24-醋酸酯2.7 mg/mL，9-HODE为7.8 mg/mL。4℃保存，使用前水浴加温至37℃。

2.2 储备液的配制

精密称取地西泮适量，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制得浓度为200 μg/mL的储备液；分别精密称取人参皂苷Rb1、泽泻醇A-24-醋酸酯与9-HODE适量，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制得浓度分别为400 μg/mL、40 μg/mL、400 μg/mL的储备液。所有储备液置于-20℃冰箱保存。

2.3 工作溶液的配制

精密移取人参皂苷Rb1和泽泻醇A-24-醋酸酯储备液适量，以甲醇配成浓度如下的混合工作溶液：人参皂苷Rb1：1、2、4、10、20、40、100、200 μg/mL；泽泻醇A-24-醋酸酯：0.02、0.04、0.1、0.2、0.4、1、2、4 μg/mL；精密移取9-HODE储备液适量，以甲醇配成浓度为0.2、1、2、10、20、100、200、400 μg/mL一系列工作溶液。

2.4 标准曲线尿液、粪便样品和质控(quality control,QC)样品的配制

上述浓度的系列混合工作溶液，用空白生物样品(尿液、粪便甲醇溶液)进行1:10稀释得到标准曲线样品，浓度范围如下：人参皂苷Rb1为0.1～20 μg/mL；泽泻醇A-24-醋酸酯为0.002～0.4 μg/mL；9-HODE为0.02～40 μg/mL。

QC样品同法稀释配制，浓度如下：人参皂苷Rb1为 0.2、2、16 μg/mL；泽泻醇A-24-醋酸酯为0.004、0.04、0.32 μg/mL；9-HODE为0.1、2、32 μg/mL。

2.5 色谱检测条件

色谱柱为C18柱(1.8 μm，100 mm×2.1 mm，Agilent Technologies，美国)，流速0.3 ml/min；柱温40 ℃；进样体积10 μL;自动进样器温度4℃。流动相：A相为乙腈，B相为水(含0.1%甲酸)。

人参皂苷Rb1与泽泻醇A-24-醋酸酯洗脱方式为梯度洗脱，每个样品的分析周期为12 min。梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相洗脱程序

9-HODE洗脱方法采用A:B为80:20的等度洗脱条件，流速为 0.3 mL/min；样品的分析周期为4 min。

2.6 质谱检测条件

采用ESI-离子源，雾化气与干燥气均为氮气；碰撞气为高纯氮气，各检测成分的质谱参数见表2；其他质谱参数优化后如下：离子源电压3 500 V、雾化器流速10 L/min、雾化器温度350 ℃、干燥气温度350 ℃、干燥气流速10 L/min、扫描频率2 amu/s、扫描范围100～1 300 amu、雾化器压力50 V、毛细管电压3 500 V。

表2 待测成分和内标物的质谱检测参数

注：Ginsenoside Rb1：人参皂苷Rb1；Alisol A 24-acetate：泽泻醇A-24-醋酸酯；9-HODE：9-羟基(10E,12E)十八碳二烯酸；Diazepam：地西泮

2.7 尿液及粪便样品的采集

取SD大鼠6只，雄性，给药前禁食12 h，自由饮水，灌胃给予花旗泽仁水煎液，剂量为花旗泽仁组1 mL/100 g体质量。于给药前及给药后12 h采集尿液、粪便样本，收集到的尿液6 000 rpm离心10 min，取上清液-80℃保存；收集到的粪便阴干后置于-80℃保存。

2.8 尿液、粪便样品预处理方法

取尿液100 μL，加入同体积的地西泮内标溶液(1 μg/mL)于12 000 rpm离心10 min，取上清液0.22 μm微孔滤膜过滤后进行HPLC-MS/MS分析，进样体积为10 μL。

取碾碎混匀的粪便1 mg，加甲醇3 mL溶解, 超声10 min，取上清液100 μL，加入同体积的地西泮内标溶液(1 μg/mL)，0.22 μm微孔滤膜过滤后进行HPLC-MS/MS分析，进样体积为10 μL。

2.9 Metabolynx处理

将待测化合物可能的I相、II相代谢产物输入Metabolynx软件中，质谱数据检测误差范围设为<1×10-5，同时将质量亏损过滤应用于数据处理。采用两次UPLC串联Q-TOF/MS分析完成代谢产物的寻找与确认。首先，对经UPLC色谱分离的代谢产物进行分析，并运用Metabolynx软件寻找可能的代谢物。其次，采用与第一次相同的UPLC色谱条件，对已找寻到的可能代谢物进行MS/MS分析，以进一步确认代谢产物。本文中所有MS离子碎片都是在选择了产物分子离子峰后进行MS/MS分析的结果。

2.10 方法学验证

2.10.1 选择性

将6个不同个体的空白生物样本及添加标准品的生物样本(人参皂苷Rb1:1 μg/mL；泽泻醇A-24-醋酸酯：0.2 μg/mL；9-HODE：0.02 μg/mL；地西泮：0.5 μg/mL)按照上述方法处理生物样品后进行HPLC-MS/MS分析，比较不同空白生物样本和添加标准品的生物样本色谱图。观察待测组分和内标的出峰位置，空白生物样本中的内源性成分是否存在干扰。

2.10.2 线性范围和定量下限(lower limit of quantification，LLOQ)

以峰面积的比值y(待测组分/内标)为纵坐标，浓度x为横坐标，采用1/x加权最小二乘法进行线性回归，进行6条标准曲线的测定。LLOQ是标准曲线上的最低浓度点，其响应值应为空白生物基质干扰物响应值的5倍以上(S/N≥5)，且精密度表示为相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)应≤20%，准确度表示为偏倚(bias)应在±20%范围内。

2.10.3 基质效应和提取回收率

配制添加待测组分标准品的粪便样品(低、中、高QC浓度)，按照样品前处理操作后测定响应值(峰面积3)；将6个不同批次来源的空白生物样品待测组分测定响应值(峰面积2)；用流动相配制相应浓度不含基质的纯样品溶液测定响应值(峰面积1)。绝对基质效应的计算值为峰面积2与峰面积1的比值；提取回收率的计算值为峰面积3与峰面积2的比值。同时考察内标地西泮的基质效应和提取回收率。尿液样本预处理方法不涉及提取过程，因此不考察提取回收率。

2.10.4 精密度和准确度

采用3个不同分析日的数据对测定方法的精密度和准确度进行验证，低、中、高3个质控(quality control,QC)浓度的标准生物样品在每个分析日内进行6次测定，求算每个分析日的日内精密度和准确度，以及3批共18个数据的日间精密度和准确度。并在样品测定的不同批次中，加入QC样品进行方法学质控。

2.10.5 样品稳定性

方法学验证过程中，对分析样品的稳定性进行考察，包括3次冻融循环后的稳定性，室温下25℃放置4 h的短期稳定性，-80℃冷冻条件下保存2周的长期稳定性，以及样品处理后置于自动进样器(4℃)12 h的稳定性，将低、中、高3个QC浓度的标准生物样品在上述条件下保存后，分析测定得到的样品浓度与新配制相应浓度的QC样品进行比较，以相对偏差(RE)表示。

3 结果与讨论

3.1 方法学验证

3.1.1 选择性

图1～图2显示待测组分和内标的出峰位置，空白生物样本中的内源性成分对人参皂苷Rb1与泽泻醇A-24-醋酸酯的测定不造成干扰。由于大鼠体内含有一定量的9-HODE，因此如图1A～图2A所示空白尿液及粪便中出现9-HODE色谱峰。图中显示在上述分析条件下，人参皂苷Rb1、泽泻醇A-24-醋酸酯、9-HODE和内标的保留时间具体如下：人参皂苷Rb1为6.2 min，泽泻醇A-24-醋酸酯为9.3 min，地西泮为1.8 min，9-HODE为2.5 min。

图1 地西泮(1)、人参皂苷Rb1(2)、泽泻醇A-24-醋酸酯(3)、9-HODE(4)的尿液样品色谱图注：空白尿液(A)；空白尿液标准添加的待测组分和内标(B)；给药2 h后的实测尿液样品(C)

图2 地西泮(1)、人参皂苷Rb1(2)、泽泻醇A-24-醋酸酯(3)、9-HODE(4)的粪便样品色谱图注：空白粪便(A)；空白粪便标准添加的待测组分和内标(B)；给药2 h后的实测粪便样品(C)

3.1.2 线性范围与定量下限

2种生物样本共6条标准曲线在考察的下列浓度范围内均显示良好的线性关系，人参皂苷Rb1：0.05～10 μg/mL；泽泻醇A-24-醋酸酯：0.001～0.2 μg/mL；9-HODE：0.01～20 μg/mL。待测组分的平均回归方程见表3。

表3 待测组分在各样品中的平均回归方程和相关系数

注：Ginsenoside Rb1：人参皂苷Rb1；Alisol A 24-acetate：泽泻醇A-24-醋酸酯；9-HODE：9-羟基(10E,12E)十八碳二烯酸

用来源不同的空白样品新配LLOQ浓度点样品进行定量下限的考察。结果显示，信噪比(S/N)≥5，且精密度表示为RSD≤20%，准确度表示为bias在±20%范围内。LLOQ点的准确度和精密度均达到了要求，所得到的标准曲线线性良好。而其他待测组分未见明显的残留效应。

3.1.3 基质效应和提取回收率

表4列出了粪便样品低、中、高QC浓度的人参皂苷Rb1、泽泻醇A-24-醋酸酯和地西泮内标的基质效应和提取回收率考察结果。绝对基质效应分别为77.4%～82.5%、81.5%～87.0%及87.4%，在基质效应的程度基本一致，不随浓度发生变化，且RSD<20%，低、中、高QC浓度下不影响本分析方法的准确性和重现性。提取回收率均在80%以上，提取回收率良好，且精密度符合要求。人参皂苷Rb1、泽泻醇A-24-醋酸酯和地西泮内标在尿液中的基质效应结果见表5。在低、中、高QC浓度下基质效应均大于80%，三个浓度下基质效应的程度基本一致，且RSD<20%，变异程度较低，符合生物样品分析要求。表6中数据显示粪便在前述处理条件下，低、中、高QC浓度下9-HODE的提取回收率分别为89.2%、92.1%、90.1%，总体而言，提取回收率良好。

表4 待测组分在大鼠粪便中的基质效应和提取回收率(n=6)

注：Ginsenoside Rb1：人参皂苷Rb1；Alisol A 24-acetate：泽泻醇A-24-醋酸酯；Diazepam：地西泮

表5 待测组分在大鼠尿液中的基质效应(n=6)

注：Ginsenoside Rb1：人参皂苷Rb1；Alisol A 24-acetate：泽泻醇A-24-醋酸酯；Diazepam：地西泮

表6 9-HODE在大鼠粪便中的提取回收率(n=6)

3.1.4 精密度和准确度

如表7～8所示，2种生物样品中3种有效成分的日内与日间准确度(bias)均在±20%之间；日内与日间精密度(RSD)均小于20%，数据表明待测组分在大鼠尿液、粪便中的精密度和准确度均符合生物样品的分析要求。

表7 待测组分在大鼠尿液中的精密度和准确度

注：Ginsenoside Rb1：人参皂苷Rb1；Alisol A 24-acetate：泽泻醇A-24-醋酸酯；9-HODE：9-羟基(10E,12E)十八碳二烯酸

表8 待测组分在大鼠粪便中的精密度和准确度

注：Ginsenoside Rb1：人参皂苷Rb1；Alisol A 24-acetate：泽泻醇A-24-醋酸酯；9-HODE：9-羟基(10E,12E)十八碳二烯酸

3.1.5 样品稳定性

低、中、高三个QC浓度的标准尿液、粪便样品的3次冻融循环后的稳定性，室温下25℃放置4 h的短期稳定性，-80 ℃冷冻条件下保存2周的长期稳定性，以及样品处理后置于自动机进样器(4 ℃)中12 h的稳定性见表9～10。结果显示相对偏差均在±20%，未发现明显降解反应，表明待测组分在大鼠尿液、粪便中的稳定性符合生物样品的分析要求。

表9 待测组分在大鼠尿液中的稳定性

注：Ginsenoside Rb1：人参皂苷Rb1；Alisol A 24-acetate：泽泻醇A-24-醋酸酯；9-HODE：9-羟基(10E,12E)十八碳二烯酸

表10 待测组分在大鼠粪便中的稳定性

注：Ginsenoside Rb1：人参皂苷Rb1；Alisol A 24-acetate：泽泻醇A-24-醋酸酯；9-HODE：9-羟基(10E,12E)十八碳二烯酸

3.2 花旗泽仁中3种有效成分在尿液、粪便中的浓度

大鼠分别灌胃花旗泽仁标准混合液后，取尿液、粪便样品在上述检测条件下检测，3种有效成分均有响应，测定数据见表11。

表11 待测组分在尿液、粪便中的浓度

3.3 代谢产物结构鉴定

本实验对大鼠灌胃花旗泽仁3种有效成分(人参皂苷Rb1、泽泻醇A-24-醋酸酯及9-HODE)混合药液后，收集的尿液、粪便样本，对其中存在的3种成分的代谢产物进行结构鉴定，共发现与人参皂苷Rb1相关的代谢产物13个，主要碎片离子见表12。此外，鉴定出泽泻醇A-24-醋酸酯及9-HODE的代谢产物各1个，主要碎片离子见表13和表14。

表12 人参皂苷Rb1相关的代谢产物主要碎片离子总表

表13 泽泻醇A-24-醋酸酯代谢产物主要碎片离子

表14 9-HODE代谢产物主要碎片离子

Ginsenoside Rb1在尿液中主要以原型药物为主，此外，还有少量Ginsenoside Rb1在体内发生水解、结合、氧化和脱氢反应，其中Ginsenoside Rd、Ginsenoside Rg3、Ginsenoside Rh2、Ginsenoside F2、Ginsenoside Cpd K、Gypenoside XVII、Gypenoside LXXV、Ginsenoside Ppd均为Ginsenoside Rb1的水解代谢产物，并随着取血时间的推移，代谢产物种类逐渐增多。Monooxygenated Rb1为Ginsenoside Rb1的氧化代谢产物，经过进一步氧化生成Di-oxygenated Rb1，即：Ginsenoside Rb1的过氧化代谢产物。Dehydrogenated Rb1为Ginsenoside Rb1在体内发生脱氢反应所得。Ginsenoside Rb1与五碳糖结合生成Combined Rb1(1)，与葡萄糖结合则生成Combined Rb1(2)。主要代谢途径见图3。此外，还发现Alisol A 24-acetate及9-HODE代谢产物各一种，Alisol A为Alisol A 24-acetate的水解代谢产物，9-HODE在体内发生氧化反应生成9-oxoODE，Alisol A 24-acetate及9-HODE代谢途径见图4、图5。

图3 人参皂苷Rb1在大鼠体内代谢流程图

图4 泽泻醇A-24-醋酸酯在大鼠体内代谢流程图

图5 9-HODE在大鼠体内代谢流程图

粪便中共发现Ginsenoside Rb1代谢产物5种，分别是Ginsenoside Rd、Ginsenoside F2、Ginsenoside Cpd K及Ginsenoside Ppd，推测其为进入体内后由胃肠道菌群代谢产生。此外还发现Alisol A 24-acetate代谢产物Alisol A，未检测到9-HODE代谢产物。

4 讨论

本部分实验研究在前期药代动力学研究的基础上，建立了灵敏、有效的HPLC-MS/MS方法测定大鼠尿液、粪便中3种有效成分的浓度，并进行方法学考察，选择性、准确度、精密度、基质效应和提取回收率及稳定性考察结果均符合样品检测要求[4]。结果表明,本方法准确、重复性好、可以用于大鼠尿液、粪便中3种有效成分及其代谢产物的浓度测定。

大鼠灌胃花旗泽仁标准混合液后，我们在尿液、粪便中均检测到了人参皂苷Rb1及其相关代谢产物，其中有大量人参皂苷Rb1原型由粪便排出体外，这可能与人参皂苷Rb1的极性较大，脂溶性较差，不利于其在胃肠道吸收有关。

此外，还有少量人参皂苷Rb1在体内发生水解、结合、氧化和脱氢反应。肠道菌群可以把含量较高的G-Rb1代谢转化为G-Rd，故G-Rd是皂苷代谢后被肠道吸收利用的重要形式之一[5]。研究表明,G-Rd具有广泛的生物活性，有显著的镇痛、抗肿瘤和抗辐射等方面的作用[6]，也有文献报道人参二醇型皂苷G-Rd有一定的降血糖作用[7]3-4。C-K具有抗炎、抗过敏、抗肿瘤、神经损伤修复和保肝等作用，而且在神经系统及免疫系统方面也具有良好的调节作用[8]。此外，有研究证实人参皂苷C-K具有明显的降血糖作用[7]23-24。

我们在尿液、粪便中均检测到了Alisol A 24-acetate及其代谢产物，经结构鉴定Alisol A 24-acetate的代谢产物为Alisol A。Alisol A 24-acetate和Alisol A为四环三萜类化合物，是泽泻的主要活性成分[9]。有研究表明，泽泻中三萜类成分泽泻醇A及其醋酸酯，以及泽泻醇B、C的醋酸酯都能够降低血清中胆固醇水平，其中泽泻醇A-24-醋酸酯效果最佳。秦建国等[10]认为,从泽泻脂溶性成分提取的三萜类化合物泽泻醇A-24-醋酸酯的降血脂作用最强。许文等[11]通过用泽泻水、醇提物干预高脂饮食诱导的小鼠胰岛素抵抗模型，阐明泽泻三萜类成分具有较好的降糖作用，其中Alisol A 24-acetate和Alisol A均被证实能够明显地促进细胞葡萄糖的摄取，进而发挥降糖作用。因此我们推测花旗泽仁中的Alisol A 24-acetate及其一部分代谢产物Alisol A，共同发挥降糖、降血脂、降胆固醇的作用[12-13]。

薏苡仁通过激动过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)而发挥降糖降脂作用，其主要活性成分9-羟基-(10E，12E)-十八碳二烯酸(9-HODE)是最强的PPARγ激动剂[14-15]。我们在尿液、粪便中检测到了9-HODE，且在尿液中检测到了相关代谢物9-oxoODE，代谢产物9-oxoODE可产生类似噻唑烷二酮类(列酮类)降血糖药的调节糖、脂代谢的作用。

综上所述，本研究通过分析有效成分及其代谢产物的排泄过程，探寻花旗泽仁在体内的排泄规律及药效物质基础。这些内容有助于完善花旗泽仁药代动力学研究，为花旗泽仁的合理用药提供依据。

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