牛王刺对CIA大鼠Treg/Th17细胞平衡影响的实验研究

石江梅 王羿 梁子聪 刘运麟 朱胜章

【摘要】目的：观察牛王刺（CD）水提液对CIA诱导大鼠Treg/Th17细胞平衡的影响，探讨牛王刺抗类风湿性关节炎的作用机制。方法：CIA诱导建立关节炎模型，将50只SD大鼠随机分为正常组，模型组，阳性组，牛王刺水提液低、高剂量组，采用ELISA法检测各组血清11-1 β、IL-6及TNF-α含量，Western Bolt法检测大鼠滑膜11-1 β，IL-6，TNF-α，IL-17，ROR v t，Foxp3的蛋白表达水平。结果：与正常组比较，CIA诱导模型组大鼠血清中11-1 β、IL-6及TNF-α水平显著增高（P<0.01），滑膜中11-1 β，IL-6，TNF-α，IL-17，ROR V t的蛋白表达水平显著升高（P<0.01），而Foxp3的蛋白表达水平显著下降（P<0.01）;与模型组比较，牛王刺治疗组的血清中11-1 β、IL-6及TNF-α水平明显下降（P<0.05），滑膜中11-1 β，IL-6，TNF-α，IL-17，ROR v t的蛋白表達水平明显下降（P<0.0 5），Foxp3的蛋白表达水平明显上升（P<0.0 5），高剂量组尤为明显。结论：牛王刺可调节CIA诱导关节炎大鼠Treg/Th17细胞平衡，抑制炎性细胞因子生成，这可能是牛王刺抗RA的治疗作用机制之一。

【关键词】牛王刺;类风湿性关节炎;Treg细胞：TH17细胞;平衡

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性自身免疫性疾病，致残率高，其病因、发病机制尚不清楚[1]。众多研究认为RA的发病与体内免疫学紊乱密切相关，其中Treg/Th17细胞平衡是近年研究RA发病的焦点之一。Th17是产生重要的致炎性细胞因子IL-17的关键效应细胞，促进RA的发生和发展。而Treg细胞可抑制T细胞抗原呈递，减少炎性细胞产生，延缓或抑制RA病程进展[2]。

目前，RA在临床上没有较好的根治方案，大部分治疗药物效果不理想，副作用较大。研发疗效确切，毒副作用小的抗RA药物仍是今后研究的重要方向。我国民间使用植物药治疗RA具有悠久的历史，但许多药物的作用机制尚不明确。牛王刺为豆科植物云实Caesalpinia decapetala（ Roth.）的干燥根，常被土家族民间医师用于治疗RA。前期研究己证实牛王刺（CD）能提高大鼠痛阈，降低毛细血管通透性，抑制炎性肿胀[3]。为更好挖掘、开发民族药物资源，探讨其治疗RA的作用机制，本研究通过建立CIA大鼠模型，观察牛王刺对Treg/Th17细胞平衡的影响，为其治疗RA提供实验依据。

1 材料

1.1 实验动物

Wistar大鼠50只，清洁级，雌雄各半，由重庆第三军医大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK（渝）2012-0003。体重平均为（150±3 0）g，在清洁级实验室适应性饲养1周。

1.2 试剂及仪器

牛王刺饮片购于黔南州百姓人连锁大药房，由黔南州中医医院胡建山教授鉴定为云实Caesalpinia decapetala （Roth.）的干燥根。雷公藤多苷片（tripterygiumglycoside，TG）购于贵州汉方制药有限公司。牛II型胶原蛋白和弗氏完全佐剂（Chondrex公司），IL-1β、IL-6、TNF-αELISA试剂盒（上海江莱生物科技公司）。RORt、Foxp3抗体（Sigma公司），IL-17、β-actin抗体、二抗、DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程公司）。Leica全封闭式组织脱水机（型号ASP 300 S）、Leica全自动轮转式切片机（型号RM 2265）、Thermo公司酶标仪（型号MultiskanGO）、Eppendorf台式高速冷冻离心机（型号5427 R）、上海安亭科学仪器厂恒温箱（型号DDIL-5），其他常用生化试剂为国产分析纯。

2 方法

2.1 牛王刺水提液的制备

将牛王刺饮片烘干、磨粉，加纯净水煎煮2小时后过滤，再加纯净水煎煮l小时后过滤，合并煎液，浓缩得到牛王刺水提浓缩液（约每克相当于l克原药）。冷藏备用。

2.2 CIA的制备、模型建立与评价

CIA配制[4]：牛Ⅱ型胶原溶解在0.05mol·L^-1的醋酸中，配制成2g·L^-1的胶原溶液，4℃过夜。次日冰浴条件下，滴加等体积CFA，混合、震荡充分乳化成CIA（终浓度为lg.L^-1）。大鼠建模：常规消毒后，予O.lmL的CIA在大鼠尾根部周围作皮内注射，l周后按同法再次加强注射。模型判断标准[5]：用关节炎指数（AD作为判断标准。按大鼠关节肿胀程度分0～Ⅳ级。0级：足趾无红肿，0分;I级：足趾关节稍肿，1分;Ⅱ级：小趾关节及足趾关节肿胀，2分;III级：踝关节以下足趾肿胀，3分;Ⅳ级：包括踝关节在内的全部足趾肿胀，4分。AI值一四肢关节肿胀等级评分之和（单肢最高4分，总分为16分）。AI值≥4分的可认定造模成功，<4分的大鼠将从实验中剔除。本实验所有造模大鼠均造模成功。

2.3 动物分组及处理

50只Wistar大鼠被随机分成5组，分别为正常对照组、模型组、阳性对照组、牛王刺低剂量组、牛王刺高剂量组，每组均为10只。正常对照组不作任何处理，余组均作CIA注射造模。造模后第10天开始药物治疗，阳性对照组给予雷公藤多苷（25mg.kg^-1），牛王刺用量参考前期动物实验剂量吲，分别以50mg.kg^-1和lOOmg·kg-1作为低剂量组和高剂量组，正常对照组和模型组分别给予等体积双蒸水ig，所有大鼠按照l mL·100 g^-1g给药，1次/日。

2.4 观察指标

2.4.1 ELISA法测定血清IL-1β，IL-6，TNF-α含量

灌胃治疗31d后，断头处死大鼠取血，腹腔静脉穿刺取得血液标本后以4 000 r.mm_1离心，取血清部分，按说明书操作采用ELISA法测定血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。

2.4.2 Westem blot法检测滑膜组织IL - 17，RORγt，Foxp3的蛋白表达水平

处死大鼠后，取下大鼠踝关节滑膜组织，裂解后提取总蛋白，BCA法检测蛋白含量，上样量为30μg/孔，PCR仪100℃变性5min，获得蛋白样本，进行SDS-PAGE凝胶电泳，电压80V电泳30 min，待Marker条带跑出后，将电压调成120 V继续电泳90 min，见溴酚蓝到达理想位置时中止电泳，将凝胶电转至PVDF膜上，以5%脱脂奶粉溶液37℃封闭2h，加一抗4℃孵育过夜。TBST洗涤5minx3次，加二抗，37℃孵育1h，再次洗膜，ECL发光显影，成像，获取条带图像，用QuantityOne软件进行蛋白条带灰度分析。以p-actin作为内参对照，求出蛋白相对表达量，每个样本重复3次。

2.4.3 数据统计

应用SPSS 22.0软件统计分析，计量资料用（x±s）表示，组间比较采用One-Way ANOVA分析。方差齐时，组间两两比较采用LSD-t检验;方差不齐时，则采用非参数检验。P<0.05时，差异有统计学意义。

3 结果

3.1 血清11-1 β，IL-6，TNF-α含量比较

由图l可知，与正常对照组比较，CIA造模各组大鼠血清IL-1β，IL-6及TNF-α的含量显著升高（P<0.01）。TG组、CD-L组及CD-H组大鼠血清IL-1β，IL-6及TNF-α的含量均低于模型组（P<0.05）。CD-H组大鼠血清IL-6、TNF-a的含量低于TG组（P<0.05）。

3.2 滑膜IL - 17，RORγt，Foxp3的蛋白表达水平比较

由图2可知，与正常对照组比较，CIA造模大鼠关节滑膜中IL - 17，ROR帷的蛋白表达水平显著升高（P<0.01），而Foxp3的蛋白表达水平显著下降（P<0.01）。与模型组相比，TG组、CD-L组及CD-H组大鼠滑膜中IL-17，RORt的蛋白表达水平均明显降低（P<0.05），Foxp3的蛋白表达水平明显上升（P<0.05）。CD-H组大鼠滑膜中RORγt的蛋白表达水平低于TG组（P<0.05）。

4 讨论

RA的病变是以关节滑膜损伤、软骨和骨破坏为主，免疫失衡引起损伤性细胞因子大量释放是其病变的主要环节。11117细胞的促炎作用与Treg细胞的抑炎作用及其调节失衡在RA发病过程中占重要地位。11117细胞（T-helper 17 cells）是CD4+T细胞家族中的一个新的亚群，IL-17是其分泌的主要炎性因子，具有较强的炎性反应介导能力，与多种自身免疫性疾病的发病相关。IL-17是一种重要的炎性因子，在RA患者血清及关节液中含量明显高于正常患者，它能诱导IL-1β、IL-6及TNF-α等细胞因子表达，促进关节滑膜增生，抑制软骨修复，加速骨质破坏。临床及实验研究表明，Treg细胞（regulatory T cells）的数量及功能异常与RA发生密切相关。Treg细胞可以释放白介素-10（IL-IO）、转化生长因子一β （TGF-β）等细胞因子，抑制T淋巴细胞传递抗原，从而发挥免疫调节功能，抗衡Th17细胞及其介导的促炎作用。同时，TGF-β单独或协同IL-10作用，促进叉头状转录因子P3 （Foxp3）表达，增强Treg细胞活性，抑制Th17细胞分化。Treg细胞还可以通过SATA5通路降低RORγt的表达，发挥抑制Th17细胞活性的作用。

Treg/Th17细胞平衡成为近年来抗RA药物的切入点。实验证明，TNF-α/IL-17双抗（anti-TNF-α/IL-17 antibodies）可以抑制关节炎大鼠细胞因子、趋化因子和基质酶反应，保护软组织，恢复骨代谢平衡。GRIM-19基因的生物抑制剂通过抑制CIA大鼠11117细胞分化，增加Treg细胞的表达，从而减少IL-1β、IL-6、TNF-α，IL-17等细胞因子的表达，达到治疗RA的目的。在中医药研究方面，雷公藤多苷、人参皂苷均可上调胶原诱导关节炎大鼠外周血Treg细胞表达，降低血清IL-17含量，恢复Treg/Th17细胞平衡，发挥抗RA的作用。李凝等认为青藤碱可能通过抑制RA患者外周血Th17细胞生成，增加Treg细胞数量，产生RA的治疗作用。朱阳春等报道，补肾通督胶囊可以明显降低RA患者外周血IL-17含量，上调血清TGF-β、IL-IO含量，使Th17/Treg水平下降，缓解RA患者的临床症状。

牛王刺具有祛风除湿，散瘀止痛，解毒消肿功效，是土家族医师常用于治疗RA的经验药物，也被现代药理实验证实具有抗炎、镇痛的作用。进一步的药理作用研究，有助于揭示牛王刺对RA的治疗作用机制，为RA患者提供更多元化的用药选择。本研究结果显示，牛王刺水提物能显著降低CIA大鼠血清IL-1β、IL-6及TNF-a含量，亦能显著下调关节滑膜中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-17，ROR丫t的蛋白表达水平，以及上调Foxp3的蛋白表达水平。这提示其作用机制可能与提高Treg细胞的数量，上调Foxp3及降低RORγt的表达，从而抑制Th17细胞分化以及其介导的IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-17等细胞因子释放有关。结果表明，通过恢复Th17/Treg细胞平衡，抑制CIA大鼠滑膜细胞增生，减轻软骨和骨破坏，延缓病程进展。

综上所述，本研究证实牛王刺可能通过调节Th17/Treg细胞平衡，减轻炎症反应对关节滑膜与软骨、骨的损害，而产生治疗RA的作用。但自身免疫疾病是多种炎性因子共同参与的，并与多条信号通路互联相关，要清晰揭示牛王刺治疗RA的作用机制尚需进一步研究。

参考文献

[1]Bellucci E，Terenzi R，La PagliaG M， et al. One year in review2016： pathogenesis of theumatoidarthritis[j]. Clinica l&ExperimentalRheumatology，2016，34（05）：793.

[2]董兴高，牛王刺抗炎作用的实验研究[J].中国民族民间医药，2012，21（04）：48+50.

[3]張莹，周小莉.Th17/Treg平衡在类风湿关节炎发病和治疗中的意义[J].中国医药导报，2015，12 （24）：48-52.

[4]胡吴斌，胡玲，唐照亮等，类风湿关节炎实验动物模型研究与评述[J].中国中西医结合杂志，2011，31（09）：1290-1294.

[5]梁秀军，孙同友，董文娟等，穿山龙总皂苷对胶原性关节炎大鼠炎性细胞因子的影响[J].时珍国医国药，2013，24 （03）： 522-524.