黄曲霉真菌DNA提取方法考察及产毒菌株的鉴别

雷果平 王福 杨楸楠 陈仕伟

【摘要】目的：探索一種黄曲霉DNA快速提取、产毒菌株快速鉴别的检测方法。方法：首次比较考察了CTAB法、试剂盒法与改良碱裂解法对黄曲霉菌株DNA提取的优缺点，并采用特异性PCR对黄曲霉菌株进行产毒阴阳性鉴别。结果：改良碱裂解法可在10min内提取黄曲霉DNA，黄曲霉产毒菌株特异性PCR结果显阳性，其他菌株显阴性。结论：改良碱裂解法可快速提取黄曲霉DNA，特异性PCR可对黄曲霉产毒菌株进行快速分子鉴定。

【关键词】黄曲霉;DNA提取;产毒菌株;鉴定

黄曲霉（Aspergillus flavus）是一种腐生型好氧真菌，其次级代谢产生的黄曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是一种强致癌性剧毒物质，引起世界广泛关注。对黄曲霉菌DNA的高效提取及菌株产毒阴阳性的快速鉴别研究对保障食品及中药材的安全具有重要意义。

1 材料与仪器

1.1 实验材料

黄曲霉产毒菌株（3.4408）与两株黄曲霉非产毒菌株（3.0321、3.2572）采购于中国科学院微生物菌株保藏中心，其他黄曲霉、黑曲霉、普通青霉、朱黄青霉菌株均分离于中药材陈皮表面。

1.2 实验试剂

氢氧化钠，无水乙醇，氯化钠，异戊醇，苯酚，聚乙烯毗咯烷酮，DL2000Maker，琼脂糖，苯酚，无水乙醇，氯仿，异戊醇，PVP，Tris-HCL（JieHui Biotech Co.，China），RNA酶（Tiangen Biotech Co.，China），植物DNA提取试剂盒（TiangenBiotech Co.，China），2×Taq PCRMasterMix（Tiangen Biotech Co.，China）;引物由上海生工（SangonCo.，China）合成。

1.3 实验仪器

Retsch MM400球磨仪（德国莱驰公司）;PTC200PCR仪（美国BIO-Rad公司）;Ge1Dox XR凝胶成像系统（美国BIO-Rad公司）;DYI-8C电泳仪（北京六一仪器厂）：KRQ-300P人工气候箱（重庆英博试验仪器）。

2 实验方法

2.1 DNA提取

2.1.1 CTAB法

取少许新鲜菌体（约20mg），加入液氮进行研磨，然后加入3ml 2%CTAB（加PVP），装管;采用65 ℃水浴，时间为45min，采用13000r/min离心10min;取上清（水相）于一新离心管中，加等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），12000r/min离心10min;取上清，加等体积的氯仿：异戊醇（24：1），12000r/min离心10min;取上清，加2L的无水乙醇和NaCl溶液，-20℃沉淀30min，12000r/min离心20min;收集沉淀，采用75酒精进行冲洗，利用超净台进行真空干燥;100μlTE溶解DNA，-20℃进保存备用。加入1μl的RNA酶，37℃水浴1h;加入400μl氯仿：异戊醇（24：1），12000r/min离心10min，重复2次。

2.1.2 试剂盒法（该方法按试剂盒操作说明方法进行）。

2.1.3 改良碱裂解法

取5mg菌体，加入80μl0.5mol/LNaOH，涡旋30s，加入160μl0.1mol/LTris-HC1中和，离心后取上清作模板备用。

2.2 ITS序列的PCR扩增与电泳

ITS序列扩增采用DNA条形码通用引物ITS1/ITS4。PCR的反应条件以及扩增的程序均参考夏等的研究。PCR反应后取5μL反应液经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

3 结果

3.1 种黄曲霉DNA提取方法优缺点对比结果

从所用时间、试剂数量、仪器依赖度、有无毒性及耗费成本多方面比较CTAB法、试剂盒法及其改良碱裂解法提取黄曲霉DNA的优缺点，得出：改良碱裂解法用时最短，在耗费成本等方面均优于其他提取方法。

3.2 特异性PCR产物电泳结果

黄曲霉产毒菌株（3.4408）有一条明显的PCR扩增条带，而黄曲霉非产毒菌株（3.0321、3.2572）、黄曲霉菌株CPdI与CPd2、桔青素、黑曲霉、普通青霉以及朱黄青霉都没有条带产生。从实验结果可以看出，其经一部地验证了黄曲霉菌株（3.4408）为产毒菌株，而从中药陈皮分离鉴定出的二株黄曲霉菌株及其他三种真菌均不具有产生毒素的能力，为产毒阴性菌株。

4 讨论

PCR扩增技术被广泛应用于多基原中药材的鉴别，具有灵敏、特异及快速的优点。本研究根据黄曲霉产毒菌株关键基因aflR设计一对引物，通过实验结果能够看出该方法可以对黄曲霉产毒菌株进行有效鉴别。另外，在实验中还发现黄曲霉产毒菌株在其生长后期会产生大量的黑色菌核，需要对其进行充分的重视。

同时在本研究之中，尝试通过多重PCR以及DNA条形码技术来对黄曲霉产毒菌株开展鉴别，通过实验能够发现多重PCR技术对产毒和非产毒菌株可以进行有效地鉴别，但PCR结果容易出现非特异性扩增，很容易出现假阳性的情况;在采用DNA条形码技术来鉴别黄曲霉产毒菌株和非产毒菌株的过程之中发现，黄曲霉产毒菌株和非产毒菌株在ITS序列上存在有序列差异。

参考文献

[1]吴发红，黄东益等.几种真菌DNA提取方法的比较[J].中国农学通报，2009，25（08）：62-64.

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