基于适配体的双酚A荧光检测试纸条制备条件的优化

张 慧，姜 侃，厉永纲，胡小芳

（1.浙江省产品质量安全检测研究院，浙江 杭州 310018；2.杭州创新生物检控技术有限公司，浙江 杭州 310018）

双酚A是一种有机化工原料，被广泛用于食品包装材料以提高容器的耐高温、抗撞击等性能。近年来有研究显示，双酚A进入身体后会导致动物或人体生殖系统的异常[1-2]、性早熟[3]、不育症[4]等疾病。双酚A的污染涉及水、土壤等的污染[5]，也可通过食品包装或各种有机涂层迁移到食品中[6]，带来食品安全隐患。国家标准GB 5749-2006《生活饮用水卫生标准》中规定双酚A的限量为0.01 mg/L[7]；食品安全国家标准 GB 9685-2016《食品接触材料及制品用添加剂使用标准》，双酚A用于食品接触用涂料、涂层，以及食品接触材料及制品用粘合剂中时，其特定迁移限量为0.6 mg/kg[8]。

双酚A常用的检测方法有气相色谱-质谱法[9]、液相色谱-质谱法[10]和酶联免疫法[11]等。Minjoung Jo等人筛选出了双酚A的单链寡核苷酸适配体[12]，并且有研究者利用核酸适配体的特异性识别作用，建立了双酚A的纳米金比色法[13]。

本文采用能特异性识别双酚A的核酸适配体，制备基于适配体的双酚A荧光检测试纸条，并对试纸条的制备条件进行了优化研究。为后续建立双酚A快速检测新方法奠定了基础。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

双酚A标准品：98.5%；N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）：98%；Trition X-100 及其他试剂均为分析纯；硝酸纤维素（NC）膜：Millipore HF13504，Sartorius CN140，MDI150CNPH-N-SS40；羧基荧光微球，99 nm；核酸序列由宝生物工程（大连）有限公司合成。

实验中的核酸序列如下。

Aptamer：

5’-CCGGTGGGT GGT CAGGTG GGA TAG CGT TCC GCG TAT GGC CCA GCG CAT CAC GGG TTC GCA CCA AAA AAA AAA AAA AAA AAAAAAAAAA-NH2-3’

Test-Probe 1：

5’-TGG TGCGAA CCC GTG ATG CGC TGG GCC ATA CGC GGA ACG CTA TCC CAC CTG ACCACCCACCGG-Biotin-3’

Control-Probe 2：

5’-Biotin-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTTT-3’

1.1.2 仪器

GA-FDS-003-04连续点膜仪；DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱；FD-1冷冻干燥机；Fics100荧光检测仪。

1.2 方法

1.2.1 荧光微球的标记

荧光微球使用0.1 mol/L NaH2PO4溶液（pH=6.2）稀释，混匀。然后加入新配制的Sulfo-NHS（终浓度50 mg/mL）和EDC（终浓度50 mg/mL）混匀，37℃、1500 r/min反应20 min。4℃离心，弃上层清液。再加入0.1 mol/L HEPES溶液（pH=7.3），混匀，加入 Aptamer（核酸：乳胶质量比=100 μg/mg），混匀后37℃、1500 r/min反应1.5 h。4℃离心，弃上层清液；加入2%乙醇胺溶液封闭，37℃，1500 r/min反应40 min，离心，弃上层清液；加入乳胶保存液，4℃保存，备用。

1.2.2 C/T线溶液反应方法（点膜）

将链霉亲和素用 0.01 mol/L PBS（pH=7.4）稀释成1 mg/mL，取5μL、1 mg/mL链霉亲和素，与3.5 μL Control-probe 2（100 μmol/L）充分混合，加入31.5 μL、0.01 mol/LPBS（pH=7.4），37 ℃、1500 r/min反应0.5 h；同理制备T线溶液；将C/T线溶液点在Millipore 13504的硝酸纤维素膜上，干燥备用。

1.2.3 样本处理缓冲液和跑膜时间的选择

将荧光微球与适配体的偶联物10倍稀释液喷洒于结合垫上，冻干。硝酸纤维素膜Millipore13504上仅划线Test-Probe1，室温阴干备用。不同样本处理缓冲液：①10 mmol/L pH=8.0的Tris溶液（含 1%TX-100），②10 mmol/L pH=7.4的PBS溶液（含1%TX-100），分别点样，荧光检测仪在15 min、30 min时检测所划测试线的荧光信号强度。

1.2.4 硝酸纤维素膜（NC膜）干燥方式的选择

将C/T线处理好的硝酸纤维素膜Millipore 13504，采用阴干干燥、37℃烘干进行比较研究，结合垫喷洒适配体和荧光微球的偶联物，样本处理缓冲液点样，荧光检测仪检测。

1.2.5 不同硝酸纤维素膜的选择

将C/T线处理好的硝酸纤维素膜Millipore 13504、Satorous、MID NC膜进行 37℃烘干处理，样本处理缓冲液点样，荧光检测仪检测。

2 结果与分析

2.1 基本原理

本研究是利用核酸适配体（aptamer）可以和双酚A特异性结合的特性，并且基于竞争法检测双酚A的原理制备试纸条。试纸条中结合垫位置喷洒含有羧基的荧光微球与含有氨基的核酸适配体的偶联物；检测线（T线）位置为Test-Probe1，是与aptamer互补的核酸序列，可与aptamer中的有效序列发生反应；控制线（C线）位置为Control-Probe 2，是一段与aptamer中连接臂互补的序列，可以捕获连接臂。试纸条的颜色深浅与待测物质含量成反比，待测物质含量越高，T线颜色越浅，待测样品不含待测物质则T线颜色最深。

2.2 样本处理缓冲液和跑膜时间的优化

用荧光微球-适配体偶联物制备试纸条，在NC膜上的中间位置仅划T线，不同的样本处理缓冲体系点样，考察缓冲体系对测试信号强度的影响。检测结果见图1～4。

图1 Tris样本处理液跑膜15 min检测信号图（三条线为平行处理）

图2 Tris样本处理液跑膜30 min检测信号图（三条线为平行处理）

图3 PBS样本处理液跑膜15 min检测信号图（三条线为平行处理）

图4 PBS样本处理液跑膜30 min检测信号图（三条线为平行处理）

由图1～图4可知，使用荧光微球-适配体偶联物制备试纸条，当采用Tris样本处理缓冲液时，15 min和30 min时T线位置 （信号位置200左右）均没有荧光信号出现；当使用PBS样本处理液时，15 min时T线位置出现明显的信号峰，信号强度达到150000以上；当试纸条放置30 min时，信号位置没有变化，信号峰依然保持，并且信号强度保持不变或略有增加。研究表明，PBS样本处理缓冲液更适合荧光微球-适配体偶联物的迁移。因此，选用PBS缓冲液用于后续研究，并将试纸条的反应放置时间选择为20 min。

2.3 硝酸纤维素膜（NC膜）干燥方式的选择

在制备试纸条时，NC膜的干燥方式会对检测信号产生一定的影响，图5、图6显示了干燥方式对信号强度的影响。NC膜上划有C线和T线，C线信号在位置100左右，T线信号在位置300左右。NC膜为Millipore HF13504。

图5 NC膜干燥间阴干处理对检测信号的影响（五条线为重复实验）

图6 NC膜37℃干燥处理对检测信号的影响（五条线为重复实验）

图5 显示NC膜在干燥间阴干处理时，多数实验中C、T线信号较弱；NC膜37℃干燥处理时（图6），5次重复实验中C线、T线位置均出现了明显的信号峰。因此，认为NC膜37℃烘干处理更适合检测体系。

2.4 不同硝酸纤维素膜的选择

为进一步改善荧光检测信号，对不同的硝酸纤维素膜进行了选择，研究结果见图6～图8。NC膜上划有C线和T线，C线信号在位置100左右，T线信号在位置300左右。

图7 Satorous NC膜37℃干燥处理对检测信号的影响（五条线为重复实验）

图8 MIDNC膜37℃干燥处理对检测信号的影响（五条线为重复实验）

图6 ～图8显示，三种NC膜37℃干燥处理后，在C线、T线均有荧光信号出现，并且图6中Millipore HF13504 NC膜C、T线荧光信号较强；紫外灯下肉眼观察，均可见荧光条带，Millipore NC膜上的荧光条带较亮。因此，后续实验选择Millipore HF13504NC膜，37℃干燥处理来制备试纸条。

2.5 试纸条的制备

采用优化的条件，制备基于适配体的双酚A的荧光检测试纸条，经不含待测物质样品（空白样本缓冲溶液）跑膜，C线、T线均出现明亮的荧光条带，见图9。该试纸条可用于双酚A快速检测方法的进一步研究。

图9 制备的基于适配体的双酚A荧光检测试纸条

3 结论

本研究优化了双酚A荧光检测试纸条的部分制备条件，结果显示：采用PBS样本处理缓冲液、跑膜时间为20 min、硝酸纤维素膜37℃干燥2 h、硝酸纤维素膜为Millipore HF13504等优化条件，制备的基于适配体的双酚A荧光检测试纸条，样品中不含待测物质时，C线、T线均有明亮的荧光条带出现。该试纸条可用于基于竞争原理的双酚A快速检测方法的后续研究，为双酚A快速检测新方法的建立奠定了基础。

[1]Shizuka H,Atsuko S，David L B，et al.Low dose effect of in utero exposure to bisphenol A and diethylstilbestrol on female mouse reproduction[J].Reproductive Toxicology，2002， 16（2）：117-122.

[2] Caroline M M，Macall A C，Carlos S，et al.Mammalian development in a changing environment：exposure to endocrine disruptors reveals the developmental plasticity of steroid-hormone target organs[J].Evolution ＆ development，2003， 5（1）：67-75.

[3] 乔丽丽，郑力行，蔡德培.性早熟女童血清中双酚A，辛基酚，4-壬基酚测定和分析[J].卫生研究，2010， 39（1）：9-12.

[4] 邓茂先，吴德生，陈祥贵.双酚A雄性生殖毒性的体内外实验研究[J].中华预防医学杂志，2004， 38（6）：383-387.

[5] Ching C L， Ling Y J，Yi L K，et al.The potential role of water quality parameters on occurrence of nonylphenol and bisphenol A and identification of their discharge sources in the river ecosystems[J].Chemosphere， 2013， 91（7）：904-911.

[6] Jose A B， Maria F， Olea S，et al.Xenoestrogens released from lacquer coationgs in food cans[J].Environmental health perspectives， 1995，103（6）：608.

[7] GB 5749-2006，生活饮用水卫生标准[S].

[8] GB 9685-2016，食品接触材料及制品用添加剂使用标准[S].

[9] Abdelmonaim A，Andres J R，Evaristo B.Simultaneous determination of parabens， alkylphenols， phenylphenols， bisphenol A and triclosan in human urine， blood and breast milk by continuous solid-phanse extraction and gas charomatography-mass spectrometry[J].Journal of pharmaceutical and biomedical analysis， 2016，119：16-26.

[10]丁红春，李建林，徐逸云，等.婴幼儿奶瓶中迁移双酚A的高效液相色谱-电喷雾串联质谱检测方法研究 [J].化学分析计量， 2010，19（5）：42-45.

[11]张丽莎，吕型超，陈涵倩，等.双酚A残留酶联免疫分析方法的研究及应用[J].核农学报，2014，28（2）：234-239.

[12]Minjoung J， Ji Y A， Joohyung L，et al.Development of single-stranded DNA aptamers for sepecific bisphenol A detection[J].Oligonucleotides， 2011，21（2）：85-91.

[13]张东伟.核酸适配体应用于双酚A快速检测新方法研究[D].上海：上海应用技术大学，2016.